布鲁氏菌病(简称布病)是由布鲁氏菌引起的一种人兽共患的传染病,在世界各地都广泛流行,尤其是在发展中国家,目前,尚无有效的商品化人用疫苗,而动物疫苗多为弱毒苗,具有一定的毒性和致病力,难与自然感染区分开来,因此,研究有效的疫苗是控制动物布病的主要方法。Ahcy(S-腺苷高半胱氨酸水解酶S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase)蛋白是通过免疫蛋白质组学筛选出的羊布鲁氏菌免疫保护候选抗原蛋白,本文在已有的研究基础上,通过表达纯化得到候选抗原蛋白,并对其进行寡糖修饰,通过研究寡糖修饰蛋白的性质以及对机体细胞免疫和体液免疫的影响,为布鲁氏菌新型疫苗的研制奠定基础。方法:通过亲和层析方法对目的蛋白进行纯化,然后对纯化的目的蛋白利用EDC/NHS方法进行糖基化修饰,然后通过巨噬细胞对糖基化蛋白的吞噬作用以及对小鼠脾淋巴细胞转化的影响初步筛选出对候选抗原免疫原性增强的糖基化蛋白,进一步通过免疫小鼠,检测小鼠脾淋巴细胞转化情况,抗体水平变化情况以及小鼠脾淋巴细胞培养上清的细胞因子含量来观察小鼠体内免疫情况,并采用布鲁氏菌16M,免疫剂量为1×107CFU/只对糖蛋白免疫的小鼠进行攻毒实验来研究糖基化修饰作用对蛋白免疫保护作用的影响。最后对糖基化蛋白的性质进行研究,包括利用高效液相分析寡糖修饰前后的蛋白出峰时间的变化,利用双向电泳检测修饰前后蛋白质等电点的变化情况,利用圆二色谱对糖基化修饰前后的蛋白的二级结构等蛋白质性质进行研究。结果:1、通过化学方法对候选抗原进行甘露寡糖、几丁寡糖修饰,发现在糖:蛋白的投料比在1000:1时糖蛋白的实际反应比值达到最大;以浓度为0.3μmol/ml的糖蛋白作用巨噬细胞,吞噬时间为4h时,发现巨噬细胞对甘露五糖修饰的RS-α蛋白和甘露四、六糖修饰的Ahcy蛋白的吞噬作用明显,在吞噬4h时,巨噬细胞对上述几种糖蛋白吞噬视野内荧光强度较亮,巨噬细胞对六种几丁质糖修饰的Ahcy蛋白的吞噬作用均显著高于Ahcy原蛋白,而六种几丁质糖修饰的RS-α蛋白与原蛋白相比吞噬作用不明显。2、通过研究糖蛋白对小鼠脾淋巴细胞转化的影响发现,甘露六糖修饰的Ahcy蛋白能显著促进淋巴细胞的转化,其促淋巴细胞转化的作用是Ahcy蛋白的30倍左右,而几种几丁质糖对Ahcy蛋白和RS-α蛋白修饰后,发现六种几丁质糖修饰后两种候选抗原对小鼠脾淋巴细胞的促进转化的能力均低于原蛋白对小鼠巨噬细胞的转化效率,说明经几丁质糖修饰的候选抗原对细胞没有转化作用。3、通过检测糖蛋白免疫小鼠产生的抗体效价变化情况发现,当免疫小鼠第四周时,甘露六糖与Ahcy蛋白的投料比为1000:1组产生抗体的效价达到了最大值123000:1,利用甘露六糖、几丁六糖修饰两种候选抗原蛋白在免疫小鼠第6周时均能检测到较高水平的抗体IGg,相比较来看,甘露六糖修饰的Ahcy蛋白抗体效价在四周时能达到峰值水平,而几丁六糖修饰的RS-α蛋白从第五周才开始产生抗体。甘露六糖修饰Ahcy蛋白刺激产生细胞因子IFN-γ、IL-2水平高于原蛋白组,说明可以提高Th1型细胞免疫水平;通过攻毒保护实验发现经甘露六糖修饰的Ahcy蛋白组的脾菌数(log CFU/g)平均数为4.185±0.033,相比较原蛋白组为4.263±0.100,说明甘露六糖对Ahcy蛋白的修饰抑制了小鼠感染细菌的数量,提高了蛋白的免疫保护力。4、通过对糖基化蛋白的性质进行研究,发现Ahcy蛋白经糖基化修饰后,蛋白的等电点由5.3提高到6.1;通过反向高效液相检测蛋白修饰前后的出峰时间,A发现发现峰高最大值Ahcy大于甘露六糖修饰的Ahcy蛋白,经甘露六糖修饰的Ahcy蛋白的出峰时间较Ahcy原蛋白提前,说明经糖基化修饰的蛋白极性变大。通过圆二色谱结果发现Ahcy蛋白经糖基化修饰后蛋白的无规则卷曲增加,β-折叠的含量升高。结论:通过对小鼠脾淋巴细胞转化的影响发现甘露六糖修饰的Ahcy蛋白能显著促进淋巴细胞转化,通过检测免疫糖基化蛋白的小鼠抗体水平以及细胞因子水平发现甘露六糖修饰的Ahcy蛋白能有效促进细胞免疫及体液免疫的水平,通过对糖基化蛋白的免疫保护力的研究发现甘露六糖的修饰能提高Ahcy蛋白的免疫保护力,这些都为甘露六糖修饰Ahcy蛋白作为布鲁氏菌疫苗候选抗原奠定了试验基础。