胰腺癌(Pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)是一种恶性程度较高、预后较差的消化系肿瘤,在我国由于生活水平的提高和不良饮食生活习惯等因素,导致胰腺癌近20年来发病率增长约6倍,死亡率位居恶性肿瘤第5位。手术切除仍然是胰腺癌首选治疗方法,所以,如何提高胰腺癌的术前诊断率,严格掌握手术指征,提高手术切除率是保证胰腺癌患者获得良好疗效的关键。胰腺癌近几年流行病学研究表明其5年生存率仍然较低,约为8.5%,其中最重要的原因为其生物学行为恶性程度高,侵袭性强,病程较早时就可能伴有淋巴结转移和神经脉管的浸润,故很多患者确诊时已是疾病的进展期,较快出现局部和远处转移。由于胰腺癌缺少早期发现的标志物,因此,如何寻找胰腺癌早期发生发展的标志物,是提高患者预后的关键因素。近年来,越来越多的学者发现既往没有被受到重视的非编码基因如微小 RNA(microRNA,miRNA)、环状 RNA(circular RNA,circRNA)、长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)等与肿瘤发生、发展密切相关,部分非编码基因甚至可以作为肿瘤早期发现的标志物用于临床诊断。miRNA是真核生物中存在的一类约22～24个核苷酸大小,参与转录后基因调节的非编码单链小分子RNA,可通过特异性识别靶基因的Messenger ribonucleic acid(mRNA)的3’-UTR非翻译区(3’-UTR)并与之结合,引起靶基因mRNA翻译的抑制,从而对靶基因进行转录后表达调节,最终通过影响靶基因表达而参与肿瘤的恶性进程。通过Pubmed、万方数据库和Google学术搜索发现miRNA-7作为细胞中广泛存在的非编码抑癌基因,在众多肿瘤(包括肝癌、宫颈癌、肺癌等)的增殖及转移中起重要作用,并且是患者早期诊断的标志物及影响患者预后的关键因素,然而,在胰腺癌的增殖和转移过程中miRNA-7研究目前罕见报道。circRNA是具有基因表达调控作用的非编码RNA,其主要通过套索内含子或反向拼接的方式产生,具有结构稳定和组织表达特异性等一系列特征,这些特征赋予了 circRNA不同的功能,例如,作为miRNA海绵,能与miRNA竞争性结合,干扰miRNA对靶mRNA的抑制和调控作用,从而影响下游靶基因的表达及其蛋白的合成,此外,有研究显示circRNA不但可以抑制miRNA活性,而且,还可抑制miRNA的表达。其中具有代表性的研究即发现小脑变性相关蛋白1反义转录物(CDRlas),也称做ciRS-7,其包含了 70多个miRNA的别位点,最具特征性的就是可以抑制miRNA-7活性和表达,从而提高miRNA-7的靶基因表达影响生物学功能。最近在喉鳞状细胞癌和非小细胞肺癌的研究中,证实ciRS-7可以通过抑制miRNA-7调节信号转导和转录活化因子 3(Signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)、细胞周期蛋白E1(Cyclin E1,CCNE1)、表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)、磷脂酰肌醇-3激酶催化亚基 δ(Phosphoinositide-3 kinase,catalytic subunit delta,PIK3CD)等靶基因信号通路关键蛋白的表达影响肿瘤的增殖和侵袭特性。研究已证实EGFR/STAT3信号转导通路在乳腺癌、胶质瘤、肺癌等许多肿瘤中异常表达,并影响肿瘤的增殖和转移。基于此,我们拟探索在胰腺癌中ciRS-7和miRNA-7表达,及其对胰腺癌生物性特性的影响。进一步明确ciRS-7通过与miRNA-7竞争性结合而调节miRNA-7靶基因EGFR等表达,进而影响EGFR/STAT3信号通路活性的作用和机制,探索ciRS-7影响胰腺癌生物学特性的机制。查阅文献后发现迄今为止相关文献报道较少。本课题主要分为三个部分:第一部分ciRS-7与miRNA-7在胰腺癌组织中的表达及临床意义研究目的:研究ciRS-7与miRNA-7等在胰腺癌组织中的表达情况,并探索ciRS-7在组织中的表达与胰腺癌生物学特性的关系,如与肿瘤的发生发展,侵袭和转移的关系,并分析ciRS-7对胰腺癌临床预后预测的意义。研究方法:本研究获得安徽省立医院伦理委员会批准,在安徽省立医院普外科共获取胰腺癌及癌旁组织标本41例,所有胰腺癌患者均签署知情同意书,进行后续研究。1.通过实时定量 PCR(Quantitative Real-time PCR,QRT-PCR)方法检测 41 例胰腺癌及其癌旁新鲜冰冻组织标本中ciRS-7和miRNA-7表达情况,并将ciRS-7和miRNA-7的表达情况进行相关性分析,探索ciRS-7和miRNA-7的表达与肿瘤发生、发展的关系。2.将胰腺癌组织中ciRS-7的表达与临床病例资料进行统计分析,探索其表达与肿瘤位置、大小、淋巴结转移以及局部神经浸润等因素是否相关。3.通过免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)检测分析 EGFR、STAT3 在胰腺癌及癌旁等组织中的表达情况,并与临床病例资料进行统计分析。4.术后进行患者随访,分析ciRS-7的高表达对胰腺癌临床预后预测的意义。结果:1.ciRS-7在胰腺癌组织中表达高于癌旁组织,差异具有统计学意义(P=0.002),而miRNA-7在胰腺癌组织中表达低于癌旁组织,差异具有统计学意义(P=0.048)。Spearman相关性分析研究发现在胰腺癌中ciRS-7和miRNA-7表达具有负相关性(P=0.023。2.对于临床资料的统计发现,ciRS-7在胰腺癌中表达水平与肿瘤是否有淋巴结转移(P=0.016)及是否有神经浸润(P=0.028)相关,而与患者的性别、年龄、有无糖尿病、肿瘤位置、肿瘤大小等无明显相关,差异无统计学意义(民P>0.05)。3.免疫组化检测发现EGFR、STAT3在胰腺癌中表达高于癌旁组织,EGFR、STAT3在胰腺癌中表达水平均与肿瘤是否有淋巴结转移(P<0.05)相关,而与患者的性别、年龄、肿瘤位置等无明显相关,差异无统计学意义(P>0.05)。4.通过随访1年后,发现在胰腺癌患者中ciRS-7高表达者的无瘤生存率低于ciRS-7低表达者,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:ciRS-7在胰腺癌中表达高于癌旁组织,miRNA-7在胰腺癌中表达低于癌旁组织,并且两者表达具有负相关性。ciRS-7的表达与肿瘤的有无淋巴结转移和有无神经浸润相关。在胰腺癌组织中EGFR、STAT3高表达并与肿瘤增殖、侵袭生物学特性有关。术后随访显示ciRS-7高表达可能是胰腺癌预后的一个评估指标。故组织学研究表明ciRS-7和miRNA-7等表达与肿瘤发生发展可能相关,并为胰腺癌的诊断和预后分析提供依据。第二部分 体外探讨ciRS-7通过miRNA-7调节EGFR/STAT3信号通路促进胰腺癌增殖和转移的作用与机制研究目的:通过体外研究探讨ciRS-7和miRNA-7在胰腺癌增殖和转移中的作用及其机制研究方法:1.通过QRT-PCR法检测胰腺癌细胞株(BXPC-3、PANC-1)以及正常胰腺细胞HPC-Y5 中 ciRS-7、miRNA-7 表达情况,通过小干扰 RNA(Small interfering RNA,siRNA)siciRS-7、simiRNA-7 实现胰腺癌 BXPC-3、PANC-1 细胞中 ciRS-7、miRNA-7的沉默。2.QRT-PCR检测ciRS-7沉默组、ciRS-7与miRNA-7同时沉默组、对照(Control)组以及阴性对照(Negative control,NC)组等各组中miRNA-7表达情况。3.通过MTT细胞增殖实验检测BXPC-3、PANC-1各组细胞增殖能力变化情况。4.Transwell小室检测BXPC-3、PANC-1各组细胞侵袭能力变化情况。5.通过QRT-PCR法及Western blotting法检测各组中EGFR/STAT3的表达情况。6.各实验组细胞中加入EGFR/STAT3信号通路的特异性阻断剂吉非替尼后,再通过MTT细胞增殖试验和Transwell小室法检测各组细胞的增殖和侵袭能力变化的情况。结果:1.胰腺癌细胞BXPC-3及PANC-1中ciRS-7表达均高于正常胰腺细胞HPC-Y5(P<0.05)。siciRS-7、simiRNA-7 可有效沉默 ciRS-7、miRNA-7 在 BXPC-3 和 PANC-1中的表达。并分别在BXPC-3及PANC-1细胞系中筛选出ciRS-7低表达最明显的siciRS-7-1,和 ciRS-7 与 miRNA-7 同时低表达的 siciRS-7-1+simiRNA-7 用于后续研究。2.QRT-PCR检测发现siciRS-7-1组中miRNA-7表达情况高于Control组和NC组(P<0.05);siciRS-7-1+simiRNA-7 组中 miRNA-7 表达与 Control 组相比差异无统计学意义(P>0.05)。3.通过MTT法发现siciRS-7-1组癌细胞的增殖能力明显低于Control组和NC组(P<0.05),而siciRS-7-1+simiRNA-7组细胞的增殖能力与Control组相比差异无统计学意义(P>0.05)。Transwell小室法发现siciRS-7-1组癌细胞的侵袭能力明显低于Control 组和 NC 组(P<0.05),siciRS-7-l+simiRNA-7 组细胞的侵袭力与 Control 组相比差异无统计学意义(P>0.05)。4.siciRS-7-1组胰腺癌细胞中EGFR、STAT3的表达低于Control组(P<0.05),siciRS-7-1+simiRNA-7组中EGFR、STAT3的表达与Control组相比差异无统计学意义(P>0.05)。5.加入EGFR/STAT3阻断剂吉非替尼后,siciRS-7-1组中对于细胞的增殖和侵袭能力无明显影响(P>0.05),而Control组加入吉非替尼后的增殖和侵袭能力变化明显(P<0.05)。结论:体外研究阐明了在胰腺癌细胞中ciRS-7高表达,下调ciRS-7可促进miRNA-7上调表达,从而抑制miRNA-7下游的靶基因信号通路EGFR/STAT3表达,最终抑制肿瘤的增殖和转移过程,表明了 ciRS-7可促进胰腺癌细胞的增殖和转移,这些为肿瘤靶向治疗提供研究基础。第三部分 体内探讨c iRS-7通过miRNA-7调节EGFR/STAT3信号通路促进胰腺癌增殖和转移的作用与机制研究目的:通过体内实验研究验证ciRS-7可通过miRNA-7调控EGFR/STAT3信号通路影响胰腺癌的增殖和转移。研究方法:1.将siciRS-7-1、siciRS-7-1+simiRNA-7等胰腺癌PANC-1细胞分别注射在裸鼠皮下和腹腔,成功建立胰腺癌的裸鼠皮下移植瘤和腹腔转移瘤模型。2.对于皮下移植瘤模型,饲养4周后,处死裸鼠剥取肿瘤后称重和测量体积。对于腹腔转移瘤模型,观察裸鼠腹部情况,饲养4周后处死各组裸鼠,观察各组裸鼠的肝肺转移情况。3.应用QRT-PCR法检测各种模型肿瘤组织中miRNA-7表达情况。4.应用免疫组化检测各种模型肿瘤组织中EGFR、STAT3蛋白的表达情况。结果:1.成功建立胰腺癌裸鼠皮下移植瘤和腹腔转移瘤模型。2.siciRS-7-1组皮下移植瘤的体积和瘤重明显小于Control组(P<0.05)。腹腔转移瘤模型中siciRS-7-1组的肝肺转移的发生情况明显少于Control组(P<0.05)。3.QRT-PCR发现miRNA-7在两种模型的siciRS-7-1组中表达均高于Control组(P<0.05)。4.免疫组化结果显示两种模型中siciRS-7-1组的EGFR、STAT3蛋白阳性表达均低于Control组(P<0.05)。结论:体内实验进一步证实在胰腺癌中下调ciRS-7可促进miRNA-7的表达,并可通过抑制其下游的靶基因信号通路EGFR/STAT3表达抑制肿瘤的增殖和转移过程。全文结论:ciRS-7在胰腺癌组织中的表达明显高于癌旁组织,其表达与肿瘤的淋巴结转移和神经浸润进程有一定的相关性,是评估胰腺癌预后的重要指标。在胰腺癌细胞中ciRS-7高表达,下调ciRS-7表达可促进miRNA-7上调表达从而抑制EGFR/STAT3信号通路抑制肿瘤的增殖和侵袭。综合研究表明ciRS-7通过miRNA-7调节EGFR/STAT3信号通路促进胰腺癌增殖与转移。ciRS-7有望为胰腺癌的早期诊断和治疗提供新的潜在靶点,为后续肿瘤基因靶向治疗提供研究基础。