研究背景及目的目前虽然对于肿瘤的发病机理和肿瘤基因靶向治疗方面已经取得了巨大的进展,但是,肿瘤仍然是危害人类健康的一个重大问题。由于近年来WHO提倡开展肿瘤的早期预防、早期诊断以及早期治疗,结直肠癌（Colorectal cancer, CRC）的发病率和死亡率开始呈现逐年下降的趋势,尽管如此,每年全球有超过100万的新发病例,其中有近一半的病例发生死亡,并且结直肠癌仍然是引起肿瘤相关性死亡的第三大病因。在我国,CRC发病的一个主要特点是40岁以上的男性为高发人群,而且近年来还呈现低龄化的趋势。在结直肠的治疗方面,常规结肠手术根治切除以及不断更新发展的辅助性放化疗（chemo-radiotherapy, CRT）虽然可以提高患者的生存率,但是结直肠癌复发和转移仍然是导致肿瘤相关性死亡的重要原因之一,已经严重威胁我国人民的身心健康。尽管众多专家学者对结直肠癌发生、发展以及转移机制等方面进行了大量基础与临床研究,但是其详细作用机制尚未完全明确。因此,从基因水平和蛋白水平,以及分子生物学水平上探索CRC细胞增殖和侵袭能力以及肿瘤细胞生长调控相关机制的研究,对于CRC的早期预防、早期诊断和提高生存率具有重要意义。RNA干扰（RNA interference, RNAi）技术是Fire等学者于1998年在对秀丽新小杆线虫的基因组研究计划时发现的,并首先阐述dsRNA能选择性及特异性地抑制目的基因的表达,而命名为RNAi技术。此后,RNAi技术便在全球范围内广泛的开展和应用,研究人员发现无论在真核生物还是哺乳动物细胞中均存在RNAi干扰现象。RNAi是近年来用于基因研究的一项新技术,在研究肿瘤发生、发展和转移过程中,RNAi可用于研究任何有异常高表达的基因的功能。RNAi是一种由双链RNA序列引起的特异性转录后基因沉默过程,它能导致特定目的基因沉默,并提供了强大的反向遗传学的方法来分析基因在体外和体内的功能。目前在实验研究中,使用最广泛的核酸序列特异性基因沉默分子是一种小分子干扰RNA（Small interfering RNA, siRNA）,被称为siRNA,它呈对称结构的,通常是由21-23个碱基对组成。此方法能够特异地,有效地抑制目标基因的表达。基因治疗（gene therapy）是将功能基因转移至患者体内纠正有缺陷的基因,使患者重新恢复基因原来功能,以达到临床治疗的目的。RNAi技术是由双链RNA启动序列特异性的基因沉默,通过细胞转染技术,可使导入DNA序列干扰癌基因表达和恢复抑癌基因功能。RNAi有以下作用特点：首先,具有高度的特异性。根据碱基互补配对原则,siRNA和具有同源序列的目的mRNA发生特异性结合,导致同源mRNA的降解,使同源基因的表达沉默,而其他非同源基因的表达则不会发生变化,因此利用这一特征可以针对一些疾病开展基因治疗。其次,具有高效性。用很少量的dsRNA便可以将浓度是几倍甚至是十几倍的mRNA发生抑制降解。这是因为,首先当mRNA出现降解时,siRNA可连续地发挥降解作用；其次与RNA依赖性RNA多聚酶的作用有关,即在RNA依赖性RNA多聚酶的作用下,dsRNA开始复制,最终是产生大量的dsRNA导致mRNA降解。再者,具有高度的稳定性。siRNA分子具有非常稳定的化学结构,特别是3’端悬垂TT碱基的dsRNA。它不同于反义核酸技术,无需进行广泛的化学修饰。对于shRNA来说,由于loop环结构的插入,大大的提高了shRNA的高效性和稳定性。目前RNAi技术已经广泛应用于基因功能鉴定,基因表达、以及转录后调控等热门领域的研究中,可以为多种疾病开展基因治疗提供新的思路。本项实验即应用RNAi技术来沉默SLPI基因在结肠癌细胞的表达,来研究对体外培养的结肠癌Lovo细胞生物学形态及功能的影响。分泌性白细胞蛋白酶抑制剂（secretory leukocyte peptidase inhibitor, SLPI）是丝氨酸蛋白酶抑制因子,属于WAP家族,既是炎症抑制因子又是蛋白酶抑制剂,具有调控细胞分化增殖的能力,可能具有抑制肿瘤发生及转移作用。目前国内外文献报道SLPI与肿瘤密切相关,但它在不同肿瘤中的表达水平不同。有学者研究发现,SLPI蛋白及mRNA在胃癌患者表达升高,并且表达量与肿瘤分期密切相关,晚期胃癌明显高于早期胃癌,有浆膜浸润者明显高于无浆膜浸润者。而在前列腺癌组织中,与正常前列腺组织相比SLPI表达是下调的,因此推测SLPI可能作为抑癌基因在前列腺肿瘤的发生及发展中起作用,可能推测SLPI在不同肿瘤组织中作用的机制不同,导致蛋白的表达水平不一。目前尚没有关于SLPI基因与结肠癌研究方面的相关报道。我们首先运用组织芯片技术,回顾性分析厦门市第二医院普通外科2008年1月至2012年12月行手术切除的150例结肠癌组织及癌旁正常组织标本,应用免疫组织化学方法探讨结肠癌组织中SLPI蛋白的表达是否与肿瘤细胞的分化程度、肿瘤临床TNM分期以及有无淋巴结转移等临床病理因素存在相关性。然后,应用RNAi技术抑制SLPI蛋白及SLPImRNA在结肠癌Lovo细胞中的表达,观察对肿瘤细胞生物学功能的影响,为揭示SLPI在结肠癌发生、发展中的作用提供依据,同时为结肠癌的治疗及早期诊断研究开辟新的思路。方法第一章回顾分析在厦门市第二医院普通外科2008年1月至2012年12月行手术切除的150例结肠癌组织及癌旁正常组织标本,用10%甲醛固定后石蜡包埋存档,所有标本均详细记载病人基本信息,记录肿瘤TNM分期,分化程度,淋巴结转移和远处转移情况。采用免疫组织化学SP法检测SLPI蛋白在不同组织标本间表达水平的差异,一抗采用鼠抗人SLPI单克隆抗体,抗体购于美国Santa Cluz公司,实验步骤按试剂盒说明书进行。结果判断标准如下：阴性为无色,阳性为细胞质染色呈棕黄色。根据阳性染色细胞所占的百分数计分：在高倍视野下每张切片选择10个有代表性的视野,每个视野计数一百个肿瘤细胞,共计数一千个细胞。将阳性细胞数小于或等于5%计为0分；阳性细胞数10%-25%计为1分；阳性细胞数25%-50%计为2分；阳性细胞数大于50%计为3分；将0-2分计为低表达；3分计为高表达。采用免疫组织化学SP方法检测SLPI在结肠癌组织中的表达水平与患者性别、年龄、分化程度,TNM分期以及淋巴结转移、远处转移等临床病理因素之间的关系。第二章我们应用RNAi技术沉默SLPI基因,分别应用qRT-PCR和Western blot检测siRNA对SLPImRNA及SLPI蛋白的沉默水平；MTT方法检测SLPI蛋白沉默对结肠癌Lovo细胞增殖能力的影响；细胞粘附实验检测SLPI蛋白沉默对细胞粘附能力的影响；细胞划痕试验和Transwell实验评价SLPI蛋白沉默对结肠癌Lovo细胞的迁移能力的影响。二统计学处理1.采用SPSS16.0统计软件进行统计学分析,计数资料的比较采用下χ2检验,对单元格的期望频数均大于1,但有小于1/5的单元格期望频数小于5,采用连续性校正χ2检验。2、细胞粘附能力、迁移能力、增殖实验的比较采用小样本student t检验,以α=0.05为检验水准,P<0.05为有统计学意义。三、结果第一章应用免疫组织化学的方法对SLPI蛋白在结肠癌中的表达情况进行分析,SLPI蛋白在癌旁正常组织中不表达,而在肿瘤组织中,SLPI阳性表达在细胞浆。分析SLPI蛋白的表达与患者的临床特征之间的关系,如表1-1,结果发现SLPI蛋白的阳性表达与肿瘤分化程度呈正相关（P<0.05）,在低分化肿瘤,SLPI的阳性表达率高,细胞染色深。此外,SLPI蛋白的表达强度与有无淋巴结转移呈现显著的相关性,有淋巴结转移的患者SLPI阳性表达率高于无转移者（P<0.05）。SLPI与肿瘤的TNM分期具有显著的相关,其中Ⅲ期和Ⅳ期患者中的SLPI的阳性表达率明显比Ⅰ期和Ⅱ期患者高（P<0.05）：而且,在是否有远处转移方面,合并远处转移患者SLPI蛋白的表达比无远处转移患者的表达水平高（P<0.05）。此外,SLPI的表达与患者年龄及性别无关（P=0.594,P=0.902）（表.1-1）。第二章实验研究通过应用RNAi技术使SLPI基因沉默,并探讨其在结肠癌Lovo细胞中的生物学作用。对于结肠癌Lovo细胞来说,合适的siRNA转染试剂比例为SiRNA75ng、转染试剂1.5u1,转染72小时后Hs-SLPI-5siRNA沉默SLPI的效果比Hs-SLPI-6siRNA能够沉默SLPI的效果稍好,因此选择Hs_SLPI₅siRNA作为干预基因用于开展相关实验研究。沉默SLPI基因的结果导致了,细胞的增殖能力下降,粘附性能增强,迁移能力降低,表明SLPI在结肠癌细胞的粘附及迁移中可能发挥重要作用。结合第一部分实验结果所示,SLPI蛋白在结肠癌组织中的表达水平比癌旁组织表达明显升高,高于癌旁组织的结果提示SLPI在细胞的侵袭和转移中的过程中可能起重要的作用,然而,其中所涉及的详细的机制还有待于开展进一步的研究。结论1、SLPI蛋白阳性反应产物主要定位在细胞浆,在正常结肠黏膜组织中未表达,但在结肠癌组织中均有表达,其高表达与肿瘤的低分化、Ⅲ-Ⅳ期,结肠癌局部淋巴结转移及远处转移有相关性,SLPI的表达强度随分化程度的降低而增加。Ⅲ-Ⅳ期肿瘤的SLPI蛋白的表达水平明显高于Ⅰ-Ⅱ期,SLPI在有淋巴结转移患者的表达水平要明显高于无淋巴结患者的水平,有远处转移患者的SLPI蛋白的表达水平要明显高于无远处转移的患者。SLPI在结肠癌的发生和发展过程中发挥重要作用,有可能成为结肠癌早期诊断的生物学标记之一。2、采用siRNA沉默结肠癌Lovo细胞株中SLPI基因,降低SLPI蛋白表达后抑制了结肠细胞增殖和迁移的能力,增强了结肠癌细胞的粘附能力。