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大花蕙兰(Cymbidium hybridum)是风靡世界的珍贵观赏花卉,属兰科(Orchidaceae)兰属,原生种产于喜马拉雅山、印度、缅甸、泰国等地,后经人工杂交选择培育而成。植株及花均大,特别是四倍体植株,花朵大而优美,花瓣厚实,花色丰富,花期长,且有较强的抗寒性,因而广受各国人民喜爱,享有“花中美女”的圣誉。目前大花蕙兰己实现了工业化育苗,但组培苗的快速生长技术尚待解决。如何提高大花蕙兰的产量与质量、缩短生长周期,促进商品化生产成为当前研究的热点。
兰科菌根真菌可与兰科植物形成互惠共生体,促进营养元素吸收,显著增加干物质的积累。此外,兰科真菌可以有效地促进兰科植物的新陈代谢活动,缩短其营养生长周期,提前开花期。本实验以大花蕙兰亲本的内生真菌为材料,筛选出能显著促进大花蕙兰生长的共生真菌。通过测定接种苗的生物量与矿质营养元素含量、显微结构与超微结构观察,研究共生真菌对大花蕙兰的促生效应与促生机制。
获得的主要研究结果如下:
(1)有利于大花蕙兰苗丛生芽增殖的培养基为MS+6-BA2mg·L-1+NAA0.3mg·L-1+椰子汁(CW)200mg·L-1+琼脂6g·L-1,增殖倍数约为3.1;有利于组培苗生根同时壮苗的培养基为MS+6-BA0.2mg·L-1+NAA0.1mg·L-1+活性碳(A.C.)0.5g·L-1+香蕉泥(BJ)100g·L-1+琼脂6g·L-1。
(2)经初步筛选,得到能促进兰花组培苗生长发育的真菌菌株共13个,其代号为:Cy5-1、Cy5-3、ZH3A-3、CL01、ML01、ZH6C-1、ZH9A”、I、d、HCL-3、CL07、HCL-2、DCLB-2。通过徒手切片观察,根段染色,形成菌根结构的菌种共5个,包括:CL01、ML01、ZH6C-1、HCL-2、HCL-3;形成假菌根的菌种2个,包括:Cy5-1、Cy5-3;此外,ZH3A-3只侵染幼苗根部根表皮细胞,但不形成菌丝结,因此将其归结为内生真菌。
(3)采用ZH3A-3(待定菌种)、CL01(Tulasnella calospora,胶膜菌属)、ML01(Epulorhiza sp.)瘤菌根菌属ZH3A-3+CL01、ZH3A-3+ML01接种大花蕙兰无菌瓶苗。菌根真菌显著促进苗生长,叶变浓绿,根系分支、根数量增多。所有接种的大花蕙兰生物量增长显著,其中以ZH3A-3+ML01混合接种后苗根长约为无菌对照苗根的2.5倍,根数增长量为对照的4倍,鲜重增长率(96%)约为对照的(44%)的2.2倍,干重约为对照的2.2倍。综合生物量指标分析显示,混合接种促进宿主生长效果优于单菌接种。ZH3A-3+ML01促进生长效果最佳。矿质元素含量分析表明,接种植株单株N、P、K元素含量均高于对照,ML01+ZH3A-3促进元素吸收效果最佳,接种苗氮元素含量为对照的1.55倍,磷元素含量为对照的1.36倍,钾元素含量为对照的1.68倍。混合接种比单菌接种对宿主矿质元素吸收促进作用更明显。
(4)显微结构观察,真菌通过通道细胞或直接侵染根毛方式侵染大花蕙兰营养根。菌根真菌入侵早期主要分布于根被细胞,后期主要分布于皮层细胞且形成菌丝结。ZH3A-3真菌主要分布在根表皮层,外皮层有少量的菌丝侵入,皮层内无菌丝结。超微结构观察发现,真菌侵染能引起临近寄主细胞的细胞壁加厚,引起寄主细胞核膨胀、变形或消失,细胞器消失等现象。菌根真菌周围内质网丰富,细胞器增加,共生界面基质中出现壁旁体。CL01与ML01菌体有明显的桶孔隔膜。
(6)暗隔丝核菌Cy5-1(Scytalidium lignicola)能与大花蕙兰另一品种064形成假菌根。生物量测定分析表明,Cy5-1主要促进兰花幼根生长,表现为根分支、增粗,新根生长。Cy5-1还显著促进大花蕙兰对矿质元素(氮元素除外)的吸收。