曼氏裂头蚴病特异性诊断抗原与实验治疗

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曼氏裂头蚴病是由曼氏迭宫绦虫(Spirometra mansoni)的幼虫(plerocercoid)-曼氏裂头蚴(sparganum mansoni)侵入人体引起的疾病。裂头蚴可侵入皮下组织可形成皮下结节,也能够侵犯腹腔内脏器、组织,还可以穿过横膈侵犯胸腔,危害最大的是侵入眼部和中枢神经系统,可导致残疾甚至危及生命。目前我国已有1000多例裂头蚴病报道,分布于27个省、市、自治区。曼氏裂头蚴可以在人体内移行,因此寄生部位多变,临床表现各不相同,并且缺乏特异性表现,造成病原学诊断时误诊、漏诊较为普遍。血清免疫学检测方法不仅创伤小,而且敏感性高、特异性强、简便快速经济,尤其对轻度感染、隐性感染、早期感染、异位寄生和深部组织寄生的病例,是一种较好的术前辅助诊断手段,可以在一定程度上弥补病原学和影像学诊断的不足。   本论文调查了河南省部分地区野生青蛙感染裂头蚴的情况;应用裂头蚴的排泄分泌(excretory-secretory,ES)抗原检测了小鼠实验感染曼氏裂头蚴后不同时间血清IgG抗体水平的变化;同时,比较了曼氏裂头蚴的ES抗原及可溶性抗原用于ELISA检测的敏感性和特异性,探讨ES抗原应用于曼氏裂头蚴病诊断的价值;另外,通过SDS-PAGE和Western blot方法鉴定了曼氏裂头蚴排泄分泌物中的特异性诊断抗原组分;并且对不同剂量吡喹酮治疗曼氏裂头蚴感染小鼠的疗效进行了初步观察。   方法:   1.调查河南省部分地区野生青蛙感染裂头蚴情况在漯河、扶沟、杞县、柘城、洛阳、濮阳、罗山、武陟等地区村庄内池塘捕捞野生青蛙,解剖青蛙,仔细检查青蛙肌肉内是否有曼氏裂头蚴寄生,并统计感染裂头蚴的青蛙数量以及青蛙感染裂头蚴条数。   2.小鼠感染曼氏裂头蚴后不同时间血清IgG抗体水平的变化48只昆明小鼠随机分为6组,每组8只,1-5组分别经口接种曼氏裂头蚴1、2、4、6及8条,6组为正常对照。感染后1周开始每周尾静脉采血,分离血清,至感染后18周。应用裂头蚴排泄分泌(excretory-secretory,ES)抗原ELISA检测血清中抗裂头蚴IgG抗体水平。   3.曼氏裂头蚴的ES抗原及可溶性抗原敏感性和特异性的比较分别应用曼氏裂头蚴ES抗原和可溶性抗原ELISA法检测感染裂头蚴、旋毛虫、弓形虫、血吸虫的小鼠和正常小鼠血清,以及曼氏裂头蚴病人、包虫病人、肺吸虫病人、肝吸虫病人、血吸虫病人和健康人血清。   4.曼氏裂头蚴排泄分泌物中抗原组分的鉴定应用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)与免疫印迹(Western blot)对曼氏裂头蚴ES抗原中的蛋白组分进行分析及鉴定,并与可溶性抗原进行比较。   5.吡喹酮对曼氏裂头蚴感染小鼠的疗效156只昆明小鼠分2批感染,每只经口(灌胃)接种感染5条裂头蚴。第1批36只小鼠分为6组(每组6只),1~5组分别接种含不同浓度吡喹酮培养液培养3 d的裂头蚴,6组接种正常培养液培养3d的裂头蚴作为对照组;第2批120只小鼠分成12组(每组10只),分别接种青蛙或蝌蚪体内的裂头蚴,1~9组于感染后1周或5周用不同剂量的吡喹酮灌胃治疗,10~12组为对照组。各组小鼠于治疗结束后1周或2周剖杀,收集裂头蚴数并计算各组的平均检出虫数和减虫率。   结果:   1.河南省部分地区野生青蛙感染裂头蚴的情况扶沟、濮阳、漯河、罗山、洛阳、柘城、杞县和武陟等地村庄内池塘野生青蛙感染裂头蚴的感染率分别为48.43%、33.33%、29.38%、25%、19.35%、14.58%、6.67%和5.88%。平均感染率达到27.18%,1只青蛙感染裂头蚴的最多数量为87条。   2.小鼠感染曼氏裂头蚴后不同时间的血清IgG抗体水平2条裂头蚴感染小鼠感染后2周的血清抗体阳性率为87.5%(7/8),感染后3周升至100%(8/8);1、4、6及8条裂头蚴感染小鼠感染后2周抗体阳性率即达100%(8/8)。5组小鼠均是在感染后1周血清抗体水平快速升高,感染后5~7周达峰值,之后抗体水平稍有下降,但至实验结束时的感染后18周抗体阳性率仍均为100%。5组小鼠感染裂头蚴后1~18周血清抗体水平间的差异有统计学意义(F=245.296,P<0.05),且抗体水平随感染剂量的增加而升高。   3.曼氏裂头蚴的ES抗原及可溶性抗原的敏感性和特异性应用曼氏裂头蚴ES抗原和可溶性抗原检测感染裂头蚴、旋毛虫、弓形虫、血吸虫的小鼠血清,二者的敏感性为100%(30/30),特异性也为100%(84/84);检测裂头蚴病人、包虫病人、肺吸虫病人、肝吸虫病人、血吸虫病人血清,二者的敏感性同样为100%(11/11),但ES抗原的特异性达到96.7%(59/61),与可溶性抗原的72.1%(44/61)相比,差异具有统计学意义(x2=14.027,P<0.05)。   4.曼氏裂头蚴排泄分泌物中抗原组分SDS-PAGE结果显示,裂头蚴可溶性抗原有19条蛋白带,分子量分别为134、129、124、108、100、80、70、56、47、45、43、40、38、36、35、32、27、24、16 kDa;ES抗原有7条蛋白带,分子量分别为66、53、42、36、29、24、20 kDa。Western blot结果表明,可溶性抗原中的36、24 kDa蛋白组分可被裂头蚴感染小鼠及裂头蚴病患者血清识别,其他蛋白组分则无抗原活性或与其他寄生虫感染小鼠或寄生虫病人血清有交叉反应;ES抗原中的36kDa蛋白组分只可被裂头蚴感染小鼠及裂头蚴病患者血清识别,而不与旋毛虫、血吸虫、弓形虫感染小鼠及正常小鼠血清产生交叉反应,与囊尾蚴病、棘球蚴病、并殖吸虫病、华支睾吸虫病、日本血吸虫病患者血清及健康人血清亦无交叉反应。   5.吡喹酮对曼氏裂头蚴感染小鼠的疗效第1批小鼠接种在10~40μg/ml吡喹酮中培养3 d的裂头蚴后,检出虫数与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05),接种在50μg/ml吡喹酮中培养3 d的裂头蚴后,减虫率仅为16.60%,各剂量组减虫率之间差异无统计学意义(P>0.05)。第2批小鼠感染青蛙体内裂头蚴1周后,用200、400、800 mg/kg吡喹酮治疗后1周和2周的检出虫数与对照组相比,差异均无统计学意义(P均>0.05),相同剂量组治疗后1周和2周后减虫率差异均无统计学意义(P均>0.05);感染蝌蚪体内裂头蚴1周后,200、400mg/kg吡喹酮治疗后1周检出虫数与对照组相比差异均无统计学意义(P均>0.05),800 mg/kg治疗后1周减虫率为17.02%,各剂量组减虫率之间差异无统计学意义(P>0.05)。小鼠感染青蛙体内裂头蚴5周后,用1200、1800mg/kg吡喹酮治疗1周和2周后,检出虫数差异无统计学意义(P>0.05),但均明显高于对照组(P均<0.05),相同剂量组减虫率之间的差异无统计学意义(P>0.05)。   结论:   1.曼氏裂头蚴ES抗原应用于裂头蚴病的ELISA检测,其敏感性与可溶性抗原相同,而其特异性优于可溶性抗原。小鼠感染不同剂量裂头蚴后2周即可用ES抗原检出血清抗裂头蚴抗体,ES抗原可用于早期与轻度感染裂头蚴病的的血清学诊断。裂头蚴ES抗原中的36 kDa蛋白组分为裂头蚴的特异性抗原。   2.较大剂量吡喹酮(1800mg/kg)对裂头蚴感染小鼠具有较好疗效。
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