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背景及目的纳米氧化锌(ZnO-NPs)的广泛应用极大地增加了职业人群在生产生活中的接触机会。ZnO-NPs经呼吸道进入机体后可导致肺部细胞出现氧化应激及炎性反应。细胞自噬作为细胞维持稳态的一种方式,其可通过降解胞内受损蛋白、影响相关信号通路等方式改变细胞状态,调节炎性反应。为探究ZnO-NPs诱发炎性反应过程中是否诱发细胞自噬,以及自噬在ZnO-NPs诱发的炎性反应中是否存在调节作用,本课题在体外实验的水平上探究不同浓度ZnO-NPs对A549细胞的炎性及自噬水平的影响,并通过调节自噬水平观察炎性反应的改变,进而更深入的探索自噬在ZnO-NPs诱发炎性反应中的作用,为预防及治疗ZnO-NPs引起的呼吸系统毒性作用提供深入的理论依据。方法1.使用浓度为0、5、10、20、40 mg/L的ZnO-NPs作用于A549细胞,采用CCK-8法测定ZnO-NPs对A549细胞活性的影响,采用乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒检测细胞上清中LDH释放量。使用酶联检测免疫试剂盒(ELISA)检测细胞上清中炎性因子IL-6、TNF-α的表达水平2.使用浓度为不同浓度0、5、10、15、20、25、30 mg/L的ZnO-NPs作用于A549细胞24 h,使用Western Blot法检测细胞自噬相关蛋白LC3B及P62表达水平的改变,选择合适的染毒浓度。使用20 mg/L ZnO-NPs刺激细胞0、4、8、12、24、48 h后,检测LC3B及P62表达水平选择合适染毒时间。采用20 mg/L ZnO-NPs刺激24 h后透射电镜对细胞中自噬小体形态进行观察。3.使用自噬抑制剂三甲基腺嘌呤(3-MA)和自噬激活剂雷帕霉素(RAPA)分别预处理细胞1 h后,以20 mg/L ZnO-NPs作用于细胞24 h,检测自噬相关蛋白LC3B、P62表达水平,细胞活性,LDH释放量及IL-6、TNF-α表达水平。结果1.ZnO-NPs对A549细胞活性的影响。随着染毒剂量的升高,细胞存活率降低。当ZnO-NPs浓度达到20 mg/L时细胞活性显著降低,为63.38%。2.ZnO-NPs对A549细胞炎性水平的影响随着染毒剂量的升高,细胞上清中LDH释放量逐渐升高。当ZnO-NPs浓度达到10 mg/L时LDH释放量显著升高(P<0.05),细胞上清中的IL-6水平显著升高。当ZnO-NPs浓度达到20 mg/L时,细胞上清中TNF-α表达水平显著升高(P<0.05)。3.ZnO-NPs对A549细胞自噬水平的影响ZnO-NPs刺激细胞后,与对照组相比LC3II水平升高,P62蛋白水平升高(P<0.05)。透射电镜观察到20 mg/L ZnO-NPs刺激细胞后,细胞中自噬小体数量明显增多。4.改变细胞自噬水平对细胞炎性反应的影响将细胞分为空白对照组、药物对照组、ZnO-NPs组及ZnO-NPs+药物组。染毒24h后,检测相应指标。4.1抑制自噬对细胞炎性反应的影响与对照组相比,ZnO-NPs组与3-MA+ZnO-NPs组自噬水平明显提高,细胞活性下降,LDH释放增加,IL-6及TNF-α表达升高。与ZnO-NPs组相比,3-MA+ZnO-NPs组细胞活性升高,LDH释放量减少,IL-6及TNF-α表达水平降低(P<0.05)。4.2激活自噬对细胞炎性反应的影响与对照组相比ZnO-NPs组与RAPA+ZnO-NPs组细胞自噬水平明显升高,细胞活性降低,LDH释放量增多,IL-6及TNF-α表达水平升高。与ZnO-NPs组相比,RAPA+ZnO-NPs组IL-6水平显著升高,而细胞活性,LDH释放量及TNF-α表达水平无明显变化。结论1.ZnO-NPs可以诱导A549细胞发生炎性及自噬反应。2.抑制自噬可以降低由ZnO-NPs诱导的A549细胞炎性反应,激活自噬对ZnO-NPs诱导的细胞炎性反应无明显影响。