背景:脑卒中是位居全世界第二常见的致死病因,同时也是导致成人致残的首要原因。发病后3-4.5h的静脉溶栓是循证医学证据支持有效的治疗方法,狭窄的时间窗及医疗条件的限制,使很多患者与之失之交臂,促使我们迫切的寻找新的有效的防治脑卒中的的方法,这样做有重要的临床的意义。脑卒中病理生理机制非常复杂,越来越多的研究发现炎症反应在脑缺血继发性脑损伤中其关键作用。多数学者认为,抗血小板聚集、颈动脉内膜切除术及颈动脉支架成形术均可以有效启动卒中的二级预防,然而除了阿司匹林和氢氯吡格雷,其他的药物对缺血性卒中的治疗疗效尚不确定,迫切需要寻求新的、更安全有效的药物,尤其需要具有明确的抗炎效果且副作用小的药物。长春西汀是从小长春花中提取的生物碱,分子式:C22H26N2O2,分子量350.5g/mol,可溶于二甲亚砜、100%乙醇及丙酮等有机溶剂,在脑血管疾病及认知功能损害的运用已经有较长时间,且已经积累较多的证据,其有效性及安全性也被众多临床试验证实,不容置疑。研究发现长春西汀可以扩张脑血管调节脑血流,然而近年研究发现长春西汀不仅能扩张脑血管,而且能发挥抗炎作用。Jeon et al发现在多种细胞类型,包括血管平滑肌细胞、人脐静脉内皮细胞、人肺腺癌细胞系A549、巨噬细胞均可观察到长春西汀抑制肿瘤坏死因子α(TNF-α)刺激出现的NF-кB活化及随后的炎症因子分泌,同时还观察到长春西汀可以抑制单核细胞的黏附和聚集。在肿瘤坏死因子α(TNF-α)或脂多糖(LPS)诱发的小鼠肺炎模型中,长春西汀抑制包括肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)和巨噬细胞炎症蛋白-2在内的炎症因子的上调,同时抑制间质内的多形核白细胞的浸润,更重要的是长春西汀作为磷酸二酯酶抑制剂可以直接抑制IKK(IκB kinase),而不是通过抑制磷酸二酯酶及调节钙通道发挥抗炎作用。以上研究表明长春西汀有明确的抗炎作用,且是通过抑制NF-κB活化及相关的炎症因子产生。TLRs是1997年发现的人的Toll受体蛋白,更为有趣的是,它与果蝇Toll蛋白同源,均属于Ⅰ型跨膜糖蛋白,TLRs启动免疫反应主要通过特异识别PAMPs(病原相关分子模式)和DAMPs(损伤相关分子模式),不仅组成先天性免疫系统的重要部分而且在获得性免疫反应信号中发挥重要作用。在中枢神经系统疾病(CNS)自身免疫反应中发挥的作用也不可忽视。研究发现TLRs有2条经典的信号转导通路,包括由Myd88介导的Myd88依赖性信号通路和由TRIF介导的Myd88非依赖性信号通路。My D88介导包括TLR4在内的多种TLRs信号转导(TLR3除外)、NF-κB和MAPKs(丝裂原活化蛋白激酶),产生多种炎症介质。而TRIF仅介导TLR3和TLR4信号转导、NF-κB活化MAPKs(病原相关分子模式),产生炎症介质。仅有TLR4既可以通过My D88,也可以通过TRIF信号通路产生肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素-1(IL-1)或干扰素-β(IFN-β)。缺血再灌注损伤后的神经元释放的DAMPs(损伤相关分子模式)能活化周围小胶质细胞的TLR4/MyD88/NF-κB信号通路,促进炎症介质的表达,促进神经元凋亡。近年研究已经发现调控TLR介导的NF-κB通路可以减轻多种器官(包括脑、心脏、肾脏等)缺血性损伤。本课题组及其他学者均发现TLR4基因敲除(TLR4-/-)小鼠在缺血再灌注损伤后的梗死面积、脑水肿等损害均较野生型小鼠轻。在缺血前使用TLR4预处理不仅能增加野生型小鼠的缺血耐受性,有时甚至能明显减轻缺血后的神经功能损伤。长春西汀作为磷酸二酯酶抑制剂已经在脑血管病和认知功能损害发挥重要作用,作为相对成熟的药物已经在临床广泛应用,可以改善缺血性脑血管病的症状,但长春西汀是否作为脑保护剂应用临床,还没有足够的证据。既往的基础研究提示长春西汀对缺血性脑血管病有一定的保护作用,但既往的研究仅仅局限于动物模型,没有从离体、在体两个方面模拟缺血性脑血管病,观察指标相对单一,也没有明确长春西汀具体作用的靶细胞,仅仅观察长春西汀可以通过抑制NF-кB发挥抗炎作用,但对于NF-кB上游信号通路研究较少,例如TLR4,由此我们大胆推测,长春西汀是否可以通过调节TLR4/MyD88/NF-κB信号通路而发挥抗炎作用保护神经细胞呢,据此,我们拟使用氧糖剥夺模型及小鼠缺血再灌注模型模拟离体、在体缺血性卒中,分别采用小胶质细胞及神经元作为靶细胞,采用TTC染色、FJB染色、TUNEL染色观察长春西汀是否对缺血性脑血管病有保护作用,采用流式细胞检测凋亡细胞、CCK8观察细胞活性和乳酸脱氢酶释放等方法观察长春西汀作用可能的靶细胞,采用Westerblotting、PT-PCR等方法从离体、在体两个层面观察TLR4信号分子及下游炎症因子的变化,进一步阐述长春西汀的抗炎作用及可能机制。方法:第一部分:长春西汀对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用1.建立小鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型,应用TTC染色和神经功能评分,检测在缺血再灌注前腹腔注射长春西汀后,对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护效应和神经功能评分的变化。2.建立小鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型,缺血再灌注前腹腔注射长春西汀,采用TUNEL染色和FJB染色观察缺血脑组织凋亡细胞和神经元变性、坏死的变化。第二部分:长春西汀通过小胶质细胞发挥对神经元的保护作用1.原代培养皮层神经元和小胶质细胞,并建立氧糖剥夺(OGD)模型,确定氧糖剥夺的最佳时间点。2.皮层神经元在氧糖剥夺前单独加入长春西汀后的细胞活性、乳酸脱氢酶的释放和凋亡细胞的变化。3.皮层神经元在氧糖剥夺前加入长春西汀和小胶质细胞行氧糖剥夺后的上清,细胞活性、乳酸脱氢酶释放和凋亡细胞的变化。第三部分:长春西汀通过下调小胶质细胞TLR4信号通路发挥保护作用1.在体WB实验,在缺血再灌注前腹腔注射长春西汀,观察TLR4信号分子的变化。2.离体WB实验,小胶质细胞在氧糖剥夺前加入长春西汀,观察TLR4信号分子的变化。3.使用RT-PCR检测缺血脑组织和小胶质细胞加入长春西汀后的TNF-α及IL-1β的表达。结果:第一部分:长春西汀对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用1.采用小鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型,缺血再灌注前腹腔注射长春西汀可以减小脑梗塞体积和改善神经功能评分。2.采用TUNEL染色和FJB染色,发现缺血再灌注前腹腔注射长春西汀可以减少凋亡细胞和神经元的变性、坏死。第二部分:长春西汀通过小胶质细胞发挥对神经元的保护作用1.神经元行氧糖剥夺(OGD)模型前,单独加入长春西汀,对细胞活性、乳酸脱氢酶释放和凋亡细胞检测,均没有变化。2.神经元在行氧糖剥夺(OGD)模型前,加入长春西汀和小胶质细胞行氧糖剥夺后的上清,细胞活性有所增加,乳酸脱氢酶释放减少,凋亡细胞减少。第三部分:长春西汀通过下调小胶质细胞TLR4信号通路发挥保护作用1.在体WB实验,缺血再灌注前腹腔注射长春西汀,可以下调TLR4、Myd88及NF-κB P65的表达,对TRIF无影响。2.离体WB实验,小胶质细胞在氧糖剥夺前加入长春西汀,可以下调TLR4、Myd88及NF-κB P65的表达,对TRIF无影响。3.无论在体还是离体实验,长春西汀均可以下调炎症因子TNF-α及IL-1β的表达结论:1.再次证明长春西汀对缺血性脑损伤有保护作用。2.长春西汀通过小胶质细胞发挥对神经元的保护作用。3.既往研究证实长春西汀可以直接抑制IKK发挥保护作用,本实验发现长春西汀可以下调TLR信号通路分子,推测长春西汀可能通过减少炎症因子的释放,负反馈下调TLR4而发挥间接保护作用。