咖啡因是一种重要的黄嘌呤生物碱,常被添加到食品饮料和药物中,因此与人类健康密切相关。咖啡因的代谢是一个酶催化的过程,主要发生在肝脏中。肝脏微粒体中的细胞色素氧化酶P450(CYP)和黄素单加氧酶(FMO)是催化咖啡因代谢的主要酶。研究咖啡因在酶催化作用下的代谢机理对生物脱咖啡因技术的发展具有十分重要的指导意义。咖啡因主要的代谢途径包括N-去甲基化和C8-氧化。N-去甲基化分为两步。首先,咖啡因通过N-甲基羟基化得到甲醇胺,然后甲醇胺通过质子转移发生分解,形成去甲基代谢产物。咖啡因通过N1-,N3-和N7-去甲基化,分别得到一级代谢产物可可碱(TB),副黄嘌呤(PX)和茶碱(TP)。此外,咖啡因可通过C8-氧化生成1,3,7-三甲基尿酸(TMU)。C8-氧化也分为两步,氧原子的亲核进攻和8-oxo-咖啡因的分子内质子转移。基于此,本文采用密度泛函理论分别对P450和FMO催化咖啡因的代谢机理进行了系统地研究。首先,本文采用非限制性杂化密度泛函UB3LYP系统地探究了细胞色素氧化酶P450同工酶CYP1A2催化咖啡因代谢的反应机理。考察了咖啡因的四条代谢路径,即N1-,N3-和N7-去甲基化(路径I-III)以及C8-氧化(路径IV)。计算结果表明,N-去甲基化过程中的决速步骤为N-甲基羟基化,该过程主要通过氢原子转移机理(HAT)完成,甲醇胺的分解是在无酶条件下进行的,主要通过邻近杂原子协助质子转移完成。C8-氧化的决速步骤是活性中心Cpd I中的氧原子对咖啡因C8原子的亲核进攻过程。研究结果表明所有反应路径均为双态反应机理(TSR)。咖啡因的代谢产物取决于Cpd I的多重度,在高自旋四重态下,N3-去甲基化(路径II)的活化能最低(14.7 kcal mol-1),为咖啡因最佳代谢路径,副黄嘌呤为CYP1A2催化下咖啡因的最优代谢产物。在低自旋双重态下,C8-氧化(路径IV)所需活化能最低(16.6 kcal mol-1),为咖啡因代谢的最优路径,因而1,3,7-三甲基尿酸为咖啡因的最优代谢产物。其次,本文采用色散校正B3LYP-D3方法研究了FMO活性中心FLHOOH催化咖啡因代谢的反应机理。咖啡因在FMO催化下的代谢路径与P450相同,仍然包括N1-,N3-和N7-去甲基化以及C8-氧化。研究结果表明:N-去甲基化过程的决速步骤仍然为N-甲基羟基化,该步骤涉及C-H键和O-O键的均裂,是一种自由基反应机理,并伴随-OOH的不完全重排构型。C8-氧化过程的决速步骤是氧原子的亲核进攻过程,主要通过氧原子转移机理完成。甲醇胺的分解和8-oxo-咖啡因分子内质子转移也倾向于邻近杂原子协助质子转移机理。C8-氧化的活化能在氯苯溶剂中最低(25.6 kcal mol-1),1,3,7-三甲基尿酸是FMO催化下咖啡因的最优代谢产物。基于FMO活性中心FLHOOH催化咖啡因的代谢机理,为了了解残基的作用,本文进一步考察了FMO活性位点重要残基Asn91和Thr92对咖啡因代谢过程中的决速步骤的影响。分别探讨了Asn91和Thr92单个残基对代谢过程的影响以及Asn91和Thr92共同作用下代谢过程的热力学和动力学性质。研究结果表明:残基Asn91与FLHOOH中的OOH基团和咖啡因通过氢键相互作用,有助于稳定过渡态结构,其活化能与FLHOOH直接催化咖啡因代谢过程相比,降低了1.7~3.4 kcal mol-1。残基Thr92的加入,能与FLHOOH中的异咯嗪环上的O2和N3-H以及咖啡因形成较强的氢键,其活化能降低了1.4~3.4 kcal mol-1。同时加入残基Asn91和Thr92时,残基Asn91与FLHOOH中的OOH基团和咖啡因均存在氢键相互作用,而残基Thr92只与FLHOOH中的异咯嗪环上的O2和N3-H存在氢键相互作用,活化能降低了1.3~4.5 kcal mol-1。因此,残基Asn91和Thr92的存在能促进FMO催化咖啡因的代谢。该研究阐述了FMO中重要残基Asn91和Thr92对咖啡因代谢过程的影响,为FMO催化咖啡因的代谢机理提供了更全面的信息。