研究背景及目的表观遗传在生命发育和疾病发生中起重要的作用,通过DNA甲基化、组蛋白共价修饰、染色体重塑及非编码RNA等途径,在不改变DNA序列的情况下,激活或抑制基因的表达,使转录组发生可逆可遗传的变化。DNA甲基化异常在肿瘤的发生发展中起到非常重要的作用。DNA甲基化修饰分为从头甲基化和维持甲基化两种途径,通过DNA甲基转移酶(DNMT1和DNMT3a、DNMT3b),将甲基基团转移到胞嘧啶(C),从而生成5-甲基胞嘧啶(5-mC)。近年来的研究发现,哺乳动物体内存在多种DNA去甲基化途径,使DNA甲基化水平呈动态变化。一方面通过复制依赖的“被动去甲基化”途径,即在复制分裂时期,阻止新链发生甲基化修饰而达到去加甲基化的效果。另一方面,还存在专门的去甲基化途径,即“主动去甲基化”。“被动去甲基化”过程已经得到广泛证实和认可,而“主动去甲基化”途径所涉及的酶仍不清楚。直到2009年,才发现TET1作为去甲基化的关键酶,可催化5-mC生成5—羟甲基胞嘧啶(5-hmC),从而酶活性介导的主动去甲基化过程才得以广泛研究。TET (Ten-Eleven translocation)蛋白,具有加双氧酶活性,在Fe2+和2-酮戊二酸(2-OG)的条件下,可以连续氧化5-mC分别生成5-hmC,5-甲酰胞嘧啶(5-fC)和5-羧基胞嘧啶(5-CaC),从而完成DNA的去甲基化。过去研究发现,肿瘤组织中5-mC、5-hmC及TET蛋白的水平均低于正常组织,但其水平的变化对肿瘤发生发展的影响还不清楚。因此我们从以下三个方面,分别探讨结直肠癌中TETs和5-mC、5-hmC水平的变化对结直肠癌发生发展的影响：1.检测结直肠癌肿瘤组织和正常组织中TETs的表达情况并分析其与病人预后的关系；2.检测基因组总5-mC、5-hmC的水平并分析其与病人临床病理参数、生存预后的相关性；3.TET1表达改变对结直肠癌细胞生物学行为的影响。第一部分结直肠癌肿瘤组织与正常组织中TETs基因表达的差异及与病人预后关系的研究收集2006-2012年浙江省台州医院109例结直肠癌患者的肿瘤组织和正常组织(取自癌旁)、相关临床资料。利用QuantiGenePlex assay检测组织中TET1、TET2和TET3基因mRNA的表达。比较TETs基因在肿瘤组织和正常组织表达差异,分析TETs表达与临床病理参数、病人预后的关系。研究结果表明：TET1和TET2在结直肠癌肿瘤组织中的表达显著低于正常组织：肿瘤组织中TET1的中位数是0.02,明显低于正常组织的表达(中位数,0.06),(P<0.01)；TET2在肿瘤组织中的中位数是0.22, 同样低于其在正常组织中的表达(中位数,0.31),(P<0.01)。但是,肿瘤组织中TET3表达(中位数,0.36)明显高于正常组织(中位数,0.22)(P<0.01)。按病人年龄、性别、肿瘤发生的部位、TNM分期、肿瘤浸润的深度、淋巴结转移和远处转移分亚组后,也得到相同结果(P均<0.05)。生存分析发现,TET1在肿瘤组织与正常组织水平的比值(C/N-TET1)高的病人,平均生存时间为40.2月,五年生存率是44%,远短于C/N-TET1水平低的病人(平均生存时间为49.5月,五年生存率是69%)。采用多因素COX比例风险模型,校正年龄、性别、TNM分期后,发现高水平的C/N-TET1的相对危险度(HR)是2.5,95%的可信区间(CI) 是1.34-4.66(P<0.01)。因此,TETl在肿瘤组织与正常组织水平的比值(C/N-TET1),可作为独立的预后危险因素用以评估病人的预后。第二部分结直肠癌肿瘤组织与正常组织中基因组总体5-mC、5-hmC的水平差异及与病人预后关系的研究109例结直肠癌病人中,我们抽提了71例病人肿瘤组织和相应正常组织的DNA。采用ELISA方法,检测142例样本中基因组总5-mC.5-hmC的水平,比较5-mC、5-hmC在肿瘤组织和正常组织水平的差异,分析5-mC、5-hmC水平与TETs表达、临床病理参数以及生存预后的关系,并根据C/N-5mC和C/N-5hmC的水平对病例进行分层,在不同分层中分析与生存预后的关系。研究结果表明：肿瘤组织中基因组总5-mC和5-hmC的水平明显低于正常组织：肿瘤组织中,5-mC的中位数是4.46%,低于正常组组织的中位数6.15%；肿瘤组织中,5-hmC水平的中位数是0.05%,远低于正常组织的中位数0.07%(P均<0.01)。按病人年龄、性别、肿瘤发生的部位、TNM分期、肿瘤浸润的深度、淋巴结转移和远处转移分亚组后,也得到相同结果(P均<0.05)。但是5-mC和5-hmC同TET蛋白表达之间无相关性(P均>0.05)。在临床病理参数的分析中发现,大于60岁或肿瘤浸润T4期的病人,C/N-5mC水平低(P<0.05)。生存分析发现,C/N-5mC高的病人,五年生存率为80%,高于C/N-5mC低的病人(五年生存率为50%),多因素COX比例风险模型校正年龄、性别、TNM分期后,发现高水平的C/N-5mC的相对危险度为0.36,95%的可信区间为0.13-0.96,因此C/N-5mC可作为独立的保护性因素提示病人预后。根据C/N-5mC和C/N-5hmC的水平对病例进行分层,发现同时具有高水平的C/N-5hmC和低水平的C/N-5mC的病人,预后最差(HR=3.48,95%CI=1.54-7.88)。第三部分TET1表达改变对结直肠癌细胞生物学行为的影响根据前面研究发现,TET1表达异常可能参与了结直肠癌的发生发展。于是我们在细胞系中探讨TET1的生物学功能。我们检测了7株结直肠癌细胞系TET1的表达情况,在高表达TET1的SW620细胞中,采用慢病毒感染的方法,构建敲除TET1的细胞系；在低表达TET1的HCT116细胞中,采用脂质体转染的方法,构建过表达TET1的细胞系。随后在构建的细胞系中采用ELISA检测基因组总5-mC和5-hmC的水平,采用Cell Counting Kit-8(CCK-8试剂盒)检测细胞增殖,以及采用Transwell小室实验检测细胞的迁移和侵袭能力。研究结果发现：TET1在SW620细胞中表达相对较高,而在其他六株细胞系(HT29,HCT116,HCT8,RKO,DLD1 和 SW480)的表达水平都相对较低；不同于组织中TETs和5-mC、5-hmC的关系,在敲除TET1的SW620细胞系中发现,基因组5-mC水平升高,而5-hmC水平降低。TET1的缺失使细胞增殖能力增强,但抑制了细胞侵袭和转移能力；在过表达TET1的HCT116细胞系中,细胞的侵袭和转移能力增强。这表明TET1可能对基因组的甲基化水平有影响,而TET1在肿瘤的发生中,不仅作为抑癌基因抑制肿瘤的增殖,可能还发挥着促进肿瘤转移的作用。因此,本次研究发现,TETs基因的表达与结直肠癌的发生、发展有关。TET1可以抑制细胞的增殖、促进细胞的迁移和侵袭。藉此完善了TET1在结直肠癌中的生物学作用。