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近年来全球猪腹泻病频发,发病规模大,导致经济损失惨重。猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus, TGEV )、猪轮状病毒 A 型(Porcine group A rotavi ruses,GAR )、猪轮状病毒 C 型(Porcine group C rotaviruses, GCR)、猪圆环病毒 2 型(Porcine circovirus2,PCV2)被认为是最主要的猪病毒性腹泻病原。这5种病毒感染率高、危害大,且存在混合感染现象,现有检测手段存在一定缺陷且难以对混合感染情况进行有效检测。本研究分别建立了针对该5种腹泻病毒的普通多重PCR和EvaGreen多重实时荧光定量PCR方法并应用于临床样品检测。普通PCR在检测中有着其独特优势而被广泛使用。本实验首先通过GenBank下载5种病毒基因序列,经软件序列比对后,在保守区分别设计5对普通PCR引物。通过对反应体系和反应条件进行优化,单重和多重普通PCR均可产生大小分别为 126bp(GCR)、242bp(GAR)、319bp(TGEV)、394bp(PEDV)、508bp(PCV2)目的产物片段。而阴性对照和非靶标阴性对照没有相应的产物产生,表明建立的单重和多重普通PCR方法具有良好的特异性。单重PCR检测GCR、GAR、TGEV、PEDV 和 PCV2 的最低限分别为 5 copies、50 copies、5 copies、5 copies、5 copies。多重普通PCR检测混合病毒模板情况的灵敏度都可以达到50 copies,和单重PCR相同或低一个数量级,但相比于先前研究报道的多重反转录PCR灵敏度(104-103 copies)提高了约2个数量级。将建立的普通多重PCR方法用于172份临床样品检测。GCR、GAR、TGEV、PEDV 和 PCV2 阳性率分别为 5.81%、2.32%、8.72%、20.92%和 46.51%,总混合感染率为22.09%,其中主要是PCV2与其它病毒存在混合感染现象,PEDV和PCV2混合感染率较高,占16.86%。挑选64个样品进行多重PCR和单重PCR对比,结果显示两者检出率相近,多重PCR检出率略低。实时荧光定量PCR包括多重实时荧光定量PCR是通过实时监测荧光信号的一种核酸片段定性定量分析方法,近来被广泛用于病原微生物检测多重实时荧光定量PCR技术在猪病毒性腹泻上的应用很少。本研究根据5种腹泻病毒扩增产物Tm值,在保守区设计5对定量PCR引物,经反应体系和参数优化,建立了基于EvaGreen荧光染料和熔解曲线分析检测这5种病毒的单重和多重荧光定量PCR方法。结果显示设计的5对病毒引物能够形成特异的熔解峰,TGEV、GAR、GCR、PEDV 和 PCV2 对应产物 Tm 值为 75.07 ± 0.15℃、77.77± 0.06℃、79.63±0.25℃、83.60 ±0.17℃和88.63 ±0.06℃,和多重荧光定量PCR各病毒溶解峰Tm值类似,而非目的基因对照和阴性对照未形成影响实验分析的非特异峰,表明建立的单重和多重荧光定量PCR方法特异性良好。批内批间重复性实验结果显示Tm值变异系数小于0.5%,Ct值变异系数小于3.5%,表明重复性良好。TGEV、GAR、GCR、PEDV和PCV2单重荧光定量PCR的检测灵敏度分别是5、5、5、5和50copies。多重实时荧光定量PCR对单个病毒TGEV、GAR、GCR、PEDV和PCV2的检测灵敏度分别为5、5、50、5和50 copies,对5个病毒混合模板的检测灵敏度都达到50 copies。将建立的EvaGreen多重实时荧光定量PCR方法应用于172份临床样品检测。TGEV、GAR、GCR、PEDV 和 PCV2 阳性率分别为 5.23%、3.48%、7.56%、25.58%和44.76%。存在两种和三种病毒的混合感染,总混合阳性率为22.66%,其中PEDV和PCV2混合感染率较高,达到18.02%。检测结果和普通PCR相近。对其中90份临床样品分别进行各病毒单重实时荧光定量PCR检测,两者检出率比较接近。表明本研究建立的多重实时荧光定量PCR方法可较好地用于临床样品5种腹泻病毒检测。