枯草溶菌素转化酶9（proprotein convrtase subtilisin/kexin9，PCSK9）是2003年发现的一个脂质代谢调节蛋白，属于前蛋白酶家族中的第九个成员。研究表明PCSK9可通过促进肝细胞的低密度脂蛋白受体(low density lipoproteinreceptor, LDLR)降解，调节肝脏脂质代谢，影响血浆LDL-C水平。 PCSK9已经成为降脂药物研发及动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)干预的热门靶点。目前研究主要是阐明了PCSK9通过调节肝脏脂质代谢从而影响血脂，间接参与As发生。但是，有研究认为除了影响血液LDL-C水平之外，PCSK9对血管壁的直接作用在As发生发展中亦发挥重要影响。因此有必要阐明PCSK9在血管壁如何直接参与As发生及其机制，为揭示PCSK9在As发病中的作用及机制提供新观点，并为确立PCSK9作为As治疗新靶点提供更充分的科学依据。血管壁巨噬细胞的脂质蓄积及炎症反应作为As发生发展中的关键环节已得到广泛认同，抑制巨噬细胞脂质蓄积和炎症反应是干预As形成的一个重要方向。巨噬细胞主要是通过清道夫受体途径荷脂，这种方式不受细胞内胆固醇浓度的负反馈调节，因此可无限制地摄入ox-LDL并沉积在胞内，导致泡沫细胞的形成，进而促进As斑块的发展。但PCSK9在巨噬细胞脂质代谢中的作用及机制尚待阐明。2010年Lan H等通过基因微阵列分析研究发现炎症和应激反应途径可能受PCSK9的调控。而我们的前期工作发现在冠心病患者血浆中PCSK9水平与IL-6、TNF-α水平均呈正相关。巨噬细胞作为动脉粥样硬化斑块中的主要炎症细胞，可分泌大量的炎性因子、趋化因子和基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases, MMP)，从而导致斑块的不稳定性，加速斑块的破裂。但PCSK9是否参与巨噬细胞的炎症因子分泌目前尚不清楚。因此，本研究提出“PCSK9通过参与巨噬细胞的脂质蓄积和炎症因子分泌而促进As发生发展”的科学假设。为回答这一科学问题，在第一部分研究中检测了PCSK9在As斑块中的表达情况以及是否与巨噬细胞共定位，并观察了氧化低密度脂蛋白（Oxidized low-density lipoprotein，oxLDL）对巨噬细胞PCSK9表达的影响；在第二部分研究中，通过构建PCSK9过表达慢病毒载体和PCSK9-shRNA慢病毒载体，上调或抑制巨噬细胞PCSK9表达，观察PCSK9表达改变对巨噬细胞脂质蓄积和炎症因子分泌的影响，并探索此过程中脂质代谢及炎症反应相关基因表达的变化；在第三部分研究中，采用ApoE-/-小鼠，通过尾静脉注射PCSK9-shRNA慢病毒载体，并高脂喂养复制As动物模型，在此基础上观察了PCSK9-shRNA对ApoE-/-小鼠As病变及其斑块脂质蓄积和局部炎症的影响，并探讨了CD36和TLR4/NF-κB信号通路在此过程中的作用。第一部分PCSK9在As斑块巨噬细胞中的表达及oxLDL对巨噬细胞PCSK9表达的影响目的：明确PCSK9在As斑块中是否表达及与巨噬细胞共定位情况；分析oxLDL对巨噬细胞PCSK9表达的影响。方法：取尸检的人As斑块以及ApoE-/-小鼠As斑块，采用免疫组织化学法检测斑块中PCSK9的表达，免疫荧光双标技术检测PCSK9在斑块中与巨噬细胞共定位情况；培养人THP-1巨噬细胞和小鼠RAW264.7巨噬细胞，采用免疫荧光细胞化学方法检测PCSK9在两种巨噬细胞中的表达情况；最后，用不同浓度ox-LDL处理两种巨噬细胞不同时间，实时定量PCR和Western blotting检测细胞PCSK9mRNA及蛋白质的表达。结果：免疫组织化学检测结果显示As斑块中PCSK9呈阳性表达，阳性染色的区域主要分布在斑块增生的内膜中，而在正常主动脉中未见PCSK9明显表达；免疫荧光双标技术检测结果显示As斑块中PCSK9阳性表达区域与巨噬细胞特异性抗原CD68阳性表达区域基本一致；免疫荧光细胞化学方法检测结果显示，PCSK9在人THP-1巨噬细胞和小鼠RAW264.7巨噬细胞均阳性表达，呈红色荧光，主要分布在细胞胞浆中；实时定量PCR和Western blotting结果显示，oxLDL呈浓度依赖性上调两种巨噬细胞PCSK9mRNA和蛋白质表达，而50μg/mloxLDL分别处理巨噬细胞不同时间后，PCSK9mRNA和蛋白质表达也上调，呈时间依赖性。小结：①PCSK9在As斑块中存在表达且与巨噬细胞共定位；②巨噬细胞中存在PCSK9表达，oxLDL呈浓度和时间依赖性上调巨噬细胞中PCSK9表达。第二部分PCSK9对oxLDL诱导的巨噬细胞脂质蓄积和炎症因子分泌的影响及机制目的：观察PCSK9表达改变对oxLDL诱导的巨噬细胞脂质蓄积和炎症因子分泌的影响及其调控分子机制。方法：1.根据设计的PCSK9基因RNA干扰靶序列，合成靶序列的双链DNA，接入GV115慢病毒载体，构建PCSK9-shRNA慢病毒载体；利用PCR方法获得小鼠PCSK9基因，并将其连接入GV287慢病毒载体，构建PCSK9过表达慢病毒载体；采用菌落PCR和DNA测序对构建的载体进行鉴定后，分别与pHelper1.0载体和pHelper2.0载体共同转染293T细胞，包装产生慢病毒颗粒，采用荧光法或实时定量PCR测定病毒滴度；两种慢病毒颗粒分别感染体外培养的小鼠RAW264.7巨噬细胞，实时定量PCR和/或Western blotting检测细胞PCSK9表达。2.以PCSK9-shRNA慢病毒载体、PCSK9过表达慢病毒载体和/或oxLDL处理RAW264.7巨噬细胞，油红O染色、Filipin染色法检测巨噬细胞胆固醇蓄积， ELISA检测细胞炎症因子分泌。3.以PCSK9-shRNA慢病毒载体、PCSK9过表达慢病毒载体分别转染RAW264.7巨噬细胞，加或不加oxLDL处理，采用实时定量PCR或Western blotting检测巨噬细胞清道夫受体CD36、SR-AI、SR-BI和炎症反应相关基因TLR4表达以及NF-κB活性。结果：1.菌落PCR和DNA测序证实，PCSK9-shRNA慢病毒载体和PCSK9过表达慢病毒载体构建正确，病毒滴度分别为5.0×108TU/ml和2.0×108TU/ml；实时定量PCR和/或Western blotting结果显示，PCSK9-shRNA慢病毒明显抑制了RAW264.7巨噬细胞PCSK9表达，而PCSK9过表达慢病毒大幅度增加了RAW264.7巨噬细胞PCSK9表达。2.油红O染色和Filipin染色结果显示，与oxLDL单独处理组相比，PCSK9低表达组细胞内胆固醇蓄积明显减少，而PCSK9过表达组细胞内胆固醇蓄积则明显增多；ELISA检测结果显示PCSK9低表达能抑制oxLDL诱导的RAW264.巨噬细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1分泌，而PCSK9过表达能促进oxLDL诱导的RAW264.巨噬细胞炎症因子分泌。3.实时定量PCR结果显示，PCSK9低表达或过表达对巨噬细胞SR-AI、SR-BImRNA表达均无影响，而CD36和TLR4mRNA表达在PCSK9干扰时下调，在PCSK9过表达时上调；Western blotting结果显示，PCSK9低表达及过表达对oxLDL诱导的RAW264.巨噬细胞SR-AI和SR-BI蛋白质表达的改变无明显的影响，但PCSK9低表达能抑制oxLDL诱导的RAW264.巨噬细胞CD36、TLR4蛋白质表达的上调，而PCSK9过表达能加剧这一效应，结果还显示，PCSK9低表达可以抑制oxLDL诱导的巨噬细胞p-IkBα表达上调、IkBα的降解以及NF-κB核转位，而PCSK9过表达的作用则与其相反。小结：①成功构建PCSK9过表达和干扰慢病毒载体；②PCSK9高表达能促进巨噬细胞脂质蓄积和炎症因子分泌，PCSK9低表达则起抑制作用；③PCSK9促进巨噬细胞脂质蓄积和炎症因子分泌与其上调CD36表达以及激活TLR4/NF-κB信号通路有关。第三部分LV-PCSK9shRNA对apoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块脂质蓄积和局部炎症因子表达的影响及机制研究目的：探索LV-PCSK9shRNA对ApoE-/-小鼠As斑块脂质蓄积和局部炎症因子表达的影响及其机制。方法：6周龄雄性ApoE-/-小鼠30只适应性喂养1周后，随机分为两组：对照组、LV-PCSK9shRNA组，每组15只，其中LV-PCSK9shRNA组通过尾静脉注射LV-PCSK9shRNA，每只鼠注射量为4×107TU/次，每6周一次。两组小鼠予以高脂喂养，12周后处死动物，采用荧光显微镜观察LV-PCSK9shRNA转染情况；分别采用免疫组织化学法、实时定量PCR及Western blotting检测主动脉PCSK9基因表达情况；全自动生化分析仪检测各组小鼠血脂水平；体视显微镜下观察、苏丹Ⅳ染色及HE染色检测主动脉粥样硬化病变面积；油红O染色、Masson染色以及Filipin染色三种方法检测主动脉窦As病变处脂质蓄积的情况；免疫荧光和免疫组织化学法检测斑块巨噬细胞浸润情况；实时定量PCR和免疫组织化学法检测主动脉TNF-α、IL-1β和MCP-1的表达；免疫组织化学或荧光法、实时定量PCR和Western blotting检测主动脉CD36、TLR4及NF-κB的表达。结果：荧光显微镜观察显示主动脉存在GFP表达；LV-PCSK9shRNA成功敲减了ApoE-/-小鼠主动脉中PCSK9基因的表达；与对照组相比，LV-PCSK9shRNA组ApoE-/-小鼠血脂水平无明显改变，但主动脉粥样硬化病变面积明显减少；油红O染色、Masson染色以及Filipin染色分析结果显示LV-PCSK9shRNA可减少ApoE-/-小鼠主动脉窦As病变处脂质蓄积；与对照组相比，LV-PCSK9shRNA组主动脉炎症因子TNF-α、IL-1β和MCP-1mRNA的表达以及主动脉窦As斑块处TNF-α、IL-1β和MCP-1蛋白质的分泌减少，并且主动脉窦As斑块中巨噬细胞浸润减少，而免疫组织化学法、实时定量PCR和Western blotting结果显示该组小鼠主动脉中CD36、TLR4表达降低、NF-κB核转位减少且活性降低。小结：抑制PCSK9表达对ApoE-/-小鼠血脂水平无明显影响，但仍能够通过减少As斑块脂质蓄积和局部炎症因子表达这一新作用途径抑制小鼠As病变形成，其机制可能与下调小鼠主动脉CD36、TLR4的表达以及降低NF-κB的活性有关。