【摘 要】
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黄瓜（Cucumis sativus）是我国北方设施栽培的主要蔬菜作物之一,其产量和品质严重受到各种生物和非生物胁迫的影响。实验室前期研究表明黄瓜翻译控制肿瘤蛋白（translationally controlled tumor protein,TCTP）在黄瓜响应白粉病菌（Sphaerotheca fuliginea）侵染过程中起到重要的调节作用。TCTP是一种普遍存在且高度保守的多功能蛋白。目
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黄瓜（Cucumis sativus）是我国北方设施栽培的主要蔬菜作物之一,其产量和品质严重受到各种生物和非生物胁迫的影响。实验室前期研究表明黄瓜翻译控制肿瘤蛋白（translationally controlled tumor protein,TCTP）在黄瓜响应白粉病菌（Sphaerotheca fuliginea）侵染过程中起到重要的调节作用。TCTP是一种普遍存在且高度保守的多功能蛋白。目前有关TCTP的研究主要集中在人和动物,TCTP参与多种细胞活动,如调控细胞和器官生长、应激反应与信号转导、疾病发生与免疫应答等。植物中有关TCTP功能研究报道尚少,但TCTP在真核生物中的高度保守性和普遍存在性,推测它们具有相似的功能。黄瓜有两个TCTP基因,我们将与拟南芥AtTCTP1（NP-188286）高度同源的命名为CsTCTP1（XP-004134215）,另一个即为CsTCTP2（XP-004135602）。本研究首先通过生物信息学和实时荧光定量PCR技术,对CsTCTP1和CsTCTP2基因进行序列和表达模式分析;其次,利用原核表达系统明确了CsTCTP1和CsTCTP2基因在非生物胁迫响应中的具体功能;同时,以CsTCTP1/CsTCTP2瞬时过表达和沉默黄瓜为试材,分析了这两个基因在黄瓜-白粉病菌互作中的作用与机制;最后,将CsTCTP1和CsTCTP2基因分别导入AtTCTP1/At TCTP2突变体拟南芥,旨在探究其参与植物逆境调控的分子机制。主要研究结果如下:（1）从黄瓜中克隆了CsTCTP1和CsTCTP2基因全长和启动子序列,并对所获序列进行生物信息学分析,表明CsTCTP1和CsTCTP2均是典型的TCTP家族成员,且与TOR信号途径密切相关。将CsTCTP1-GFP和CsTCTP2-GFP融合蛋白分别在拟南芥原生质体中瞬时表达,结果表明CsTCTP1和CsTCTP2均定位于细胞质中。（2）应用qRT-PCR技术,研究黄瓜CsTCTP1和CsTCTP2基因在不同组织、不同品种、不同逆境胁迫（白粉病菌、低温、高温、干旱以及高盐）以及不同外源物质（CaCl2、H2O2、ABA、MeJA、SA以及ETH）处理下的表达模式。结果表明,CsTCTP1和CsTCTP2基因在黄瓜中具有组织表达特异性;黄瓜CsTCTP1和CsTCTP2基因与逆境信号以及ABA信号通路密切相关;CsTCTP1和CsTCTP2基因可能是黄瓜-白粉病菌互作中的负调控因子。（3）通过双酶切方法将克隆载体上的CsTCTP1和CsTCTP2基因分别重组至原核表达载体pET30a,转化至大肠杆菌BL21中,应用1 mmol·L-1 IPTG分别成功诱导带有His标签的CsTCTP1和CsTCTP2蛋白的表达。对转化大肠杆菌进行非生物胁迫处理,发现CsTCTP1降低了原核细胞对高温、干旱以及HgCl2胁迫的耐受性,提高了对高盐的耐受性;CsTCTP2降低了原核细胞对干旱和HgCl2胁迫的耐受性,提高了对高盐和高温的耐受性。（4）通过同源重组方法将CsTCTP1和CsTCTP2基因目的片段分别重组至瞬时过表达载体pCAMBIA3301-LUC以及病毒诱导基因沉默表达载体pTRV2上,并转化至农杆菌EHA105中。应用黄瓜子叶瞬时转化手段获得CsTCTP1/CsTCTP2瞬时过表达和沉默植株。研究发现,CsTCTP1和CsTCTP2基因在黄瓜响应白粉病菌胁迫中扮演着负调控因子的角色,其中CsTCTP1可能通过调控防御相关基因及ABA信号通路相关基因的表达来参与黄瓜对白粉病菌侵染的应答,而CsTCTP2可能通过介导TOR信号途径以调控植物的防卫反应。（5）成功构建了CsTCTP1和CsTCTP2基因的植物过表达载体,并分别转入AtTCTP1/AtTCTP2突变体拟南芥中,经3代除草剂Basta抗性筛选以及分子水平鉴定,成功获得CsTCTP1/CsTCTP2基因恢复系植株,发现CsTCTP1/CsTCTP2基因的导入恢复了AtTCTP1/AtTCTP2突变体拟南芥的生长速度与长势,也为后续深入研究CsTCTP1和CsTCTP2基因参与逆境调控的分子机制提供植物材料。
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