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伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）是一种猪的病原体,其感染范围广,感染途径多样,不仅给全球的养猪业造成巨大经济损失,还会危及人与动物的生命健康。猪作为PRV的天然宿主,在PRV感染后除了神经功能障碍外,它还引起猪肺组织病变,后续发展为间质性肺炎、出血性肺炎。研究表明呼吸系统疾病大多与免疫失调、炎症平衡失控密切相关,其中免疫细胞在调控机体炎症反应中发挥重要作用。焦孔素D（Gasdermin D,GSDMD）是焦亡途径中关键的执行分子,它可以调控免疫细胞死亡与相关炎症因子的释放,近年来被视作治疗炎症失衡类型疾病的新型理想靶点。细胞焦亡广泛参与呼吸系统疾病的形成,但GSDMD在PRV感染致间质性肺炎中的作用尚不清楚。本研究成功构建PRV感染诱导的小鼠间质性肺炎模型,并利用GSDMD敲除鼠进一步探究GSDMD在PRV感染致肺组织病变过程中的作用,研究取得以下结果:1.成功构建PRV感染小鼠间质性肺炎模型扩增培养PRV-RJ野毒株和Bartha-K61疫苗株,寇氏（Karber）法测定病毒滴度。以未感染组和Bartha-K61感染组小鼠作为对照,分别构建高、低剂量的PRV感染小鼠模型。腹腔注射高剂量(2×10~5 TCID50)的PRV-RJ野毒株后,小鼠死亡时间集中在感染后48～60 h,表现出明显的神经症状,同等剂量下Bartha-K61感染组小鼠死亡时间集中在感染后8～10 d。统一在感染后48 h剖检小鼠取肺脏和脑,可见高剂量PRV-RJ感染组小鼠肺脏呈实变样,并伴有严重间质性肺炎,左侧大脑脑膜局灶性充血,“血管套”现象明显;免疫组化显示,在肺和脑组织均能检测到PRV阳性信号。高剂量Bartha-K61感染组肺脏眼观与正常组大致相同,脑无明显病变。腹腔注射低剂量(2×10~3TCID50)的PRV-RJ野毒株后,小鼠死亡时间集中在感染后96 h,感染期间小鼠表现出呼吸道症状,同等剂量下的Bartha-K61感染组小鼠不死亡,感染96 h内无明显临床症状。统一在感染后90 h剖检小鼠取肺脏和脑,可见低剂量PRV-RJ感染组小鼠肺脏呈肉红色,存在典型间质性肺炎,低剂量Bartha-K61感染组小鼠肺脏轻微肿胀。免疫组化显示,与低剂量Bartha-K61感染组小鼠相比,低剂量PRV-RJ感染组小鼠肺组织表现出更为明显的PRV阳性信号,此外,两组感染小鼠脑组织均无明显病变。上述结果表明,高剂量PRV-RJ野毒株感染小鼠会引起明显的神经症状,低剂量PRV-RJ野毒株感染小鼠主要诱导典型间质性肺炎。2.明确GSDMD缺失可以显著减轻由PRV感染引起的小鼠肺组织病变选用高(2×10~5 TCID50)、低剂量(2×10~3 TCID50)的PRV-RJ野毒株和高(2×10~5TCID50)、低剂量(2×10~3 TCID50)的Bartha-K61疫苗株分别构建四组WT小鼠和GSDMD敲除鼠感染模型。检测比较WT小鼠和GSDMD敲除鼠的生存情况、临床症状评分、组织病理变化等指标。结果显示,在高剂量PRV-RJ野毒株感染模型中,GSDMD缺失可延长小鼠存活时间,减轻小鼠临床症状,减轻肺和脑组织病变;在低剂量PRV-RJ野毒株感染模型中,GSDMD缺失可延长小鼠存活时间,甚至使小鼠不死亡,GSDMD敲除鼠的临床症状评分、肺组织病毒滴度均极显著地低于WT小鼠,GSDMD缺失能改善由PRV感染引起的肺组织病变;在高剂量Bartha-K61疫苗株感染模型中,GSDMD缺失可延长小鼠存活时间和减轻肺组织病变;在低剂量Bartha-K61疫苗株感染模型中,虽然WT小鼠和GSDMD敲除鼠均未见死亡,但GSDMD缺失可缓解感染小鼠的临床症状和肺组织病变。以上结果表明,GSDMD在不同剂量、不同株感染小鼠引起的肺组织病变过程中均有不同程度的作用,具体表现为,GSDMD缺失可减轻由PRV-RJ野毒株和Bartha-K61疫苗株感染引起的肺部炎症和病理损伤。3.明确GSDMD在PRV感染致间质性肺炎形成过程中对免疫细胞群的调控作用低剂量PRV-RJ野毒株感染WT小鼠和GSDMD敲除鼠后,通过流式细胞术检测不同感染时间点小鼠肺内免疫细胞、自然杀伤细胞（Natural killer cell,NK cell）、肺泡巨噬细胞（Alveolar macrophages,AMs）、间质巨噬细胞（Interstitial macrophages,IMs）的比例和数量变化情况。结果显示,GSDMD对PRV感染猪肺组织中的免疫细胞、NK细胞和巨噬细胞均有调控作用,具体表现为,GSDMD缺失可以在PRV感染致肺炎过程中降低免疫细胞浸润水平,稳定NK细胞和巨噬细胞的比例和数量。同时,对PRV-RJ感染后期的WT小鼠和GSDMD敲除鼠肺细胞悬液进行单细胞转录组测序。结果显示,肺组织解离后所得的细胞共分为15个cluster,进一步对两组小鼠肺内NK细胞群、AMs群和IMs群进行差异基因分析,明确了在PRV感染后期,GSDMD缺失可以使小鼠肺NK细胞中S100a6、Zeb2等基因上调,以维持NK细胞活性,发挥杀伤病毒的作用;GSDMD缺失也可以使小鼠肺AMs中与炎症和免疫系统相关的基因（如Il1b、Tnf、Cxcl3、Ccrl2等）表达下调,通过减少AMs的过度活化,避免过度的炎症反应和免疫应答;此外,小鼠肺IMs中Rnasel、Cxcl16等差异基因上调,Tsc22d3、Areg、Irf7等差异基因下调,表明GSDMD缺失一方面可以促进IMs的活化,增强抗病毒作用;一方面可以增强IMs的抗炎活性,防止感染后期引起的过度炎症。以上结果表明,GSDMD在PRV感染致间质性肺炎形成过程中对NK细胞和巨噬细胞具有重要的调控作用。综上所述,本研究明确了GSDMD缺失可以显著减轻PRV感染诱导的间质性肺炎,进一步通过单细胞测序分析明确GSDMD通过调控NK细胞、肺泡巨噬细胞、间质巨噬细胞的生长与促炎活性在PRV感染致间质性肺炎形成过程中发挥重要作用,为后续研究具体机制奠定了理论基础,同时为临床防治伪狂犬病提供了靶点。