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睾丸中精子发生异常是造成男性不育的一个主要原因,在临床上主要表现为少精、无精或精子畸形。为此,我们以小鼠正常睾丸组织支架作为3D培养支架,在体外对乳鼠睾丸细胞进行长期培养,期望建立体外生产精子的技术平台。通过3D培养我们成功获得进入减数分裂时期的细胞。并且进一步研究了从成年小鼠睾丸中分离精原干细胞的方法。主要研究结果如下：1.小鼠睾丸支架的制备：采用不同浓度的SDS对周龄为4-5w的昆明白小鼠睾丸处理不同的时间制备睾丸支架,然后对制备的支架进行组织学及生物化学的检测,筛选出制备小鼠睾丸支架的最佳条件,即1% SDS处理24h。2.乳鼠睾丸细胞的制备：从出生后5-7d的乳鼠睾丸中分离睾丸细胞,然后将其注射到小鼠睾丸支架中,进行体外3D培养。通过组织学、免疫组织化学、流式细胞技术、RT-PCR等技术检测了精子发生中不同阶段的细胞特异标记基因的表达,结果表明睾丸支架能够在体外支持乳鼠睾丸细胞的分化。3.分离纯化成年小鼠精原干细胞：采用两步酶消化法分离周龄为6-8w的昆明白小鼠的睾丸细胞,然后对其进行体外培养,通过碱性磷酸酶染色、免疫荧光染色、移植、RT-PCR检测和流式细胞术等一系列分析、鉴定,证明成年小鼠睾丸细胞在体外培养3d后再用MACS方法分选精原干细胞,能够显著提高精原干细胞的数量。本研究为建立更为可靠的精子体外成熟的方法探索了一条可能的新路,为研究人精子体外发生奠定了基础。