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目的：
沉默信息调节因子1(Silencinginformation regulator 1, SIRT1)是影响肿瘤发生和进展的重要调节分子，但关于SIRT1在肿瘤(包括卵巢癌)中发挥促癌作用抑或抑癌作用至今仍存在争议。早在十几年前，就有文献报道SIRT1存在核-质穿梭过程，但对于SIRT1的亚细胞定位在卵巢癌中的作用目前仍知之甚少。本研究的目的是探讨SIRT1亚细胞定位对卵巢癌细胞顺铂敏感性和迁移侵袭的影响及其相关机制。
方法：
1.通过构建具有野生型SIRT1、核输出序列(Nuclear Export Sequences，NESs)突变型SIRT1(SIRT1NESmt)和核定位序列(Nuclear Localization Sequences，NLSs)突变型SIRT1(SIRT1NLSmt)编码序列的慢病毒载体，转染人类卵巢癌IGROV1细胞和HEY细胞，通过筛选获得过表达野生型SIRT1、NESs突变型SIRT1和NLSs突变型SIRT1的卵巢癌稳定转染细胞株(以下简称为SIRT1细胞、SIRT1NESmt细胞和SIRT1NLSmt细胞)。
2.通过观察慢病毒载体编码的SIRT1-GFP融合蛋白的荧光定位，明确稳定转染细胞中外源性SIRT1的亚细胞定位。利用real-timePCR、Westernblot法对分离提取的核-质蛋白进行检测，证实外源性SIRT1的表达和亚细胞定位情况。通过Westernblot法检测稳定转染细胞株中已知SIRT1对p53去乙酰化作用的特异性靶位点K382的乙酰化水平，结合定量蛋白质组学和乙酰化蛋白组学检测比较IGROV1各组稳定转染细胞株中蛋白和赖氨酸残基乙酰化的整体改变水平，推测外源性SIRT1的去乙酰化酶活性。
3.使用CCK-8细胞毒性实验和流式细胞术比较顺铂处理后IGROV1和HEY各组稳定转染细胞之间的存活和凋亡情况。通过Westernblot法和超氧化物歧化酶分型检测试剂盒检测自噬相关蛋白的表达、Mn-SOD表达水平、Mn-SODK68位乙酰化水平及其酶活性，结合免疫共沉淀法探讨Mn-SOD与SIRT1的相互结合作用，以期发现SIRT1亚细胞定位对卵巢癌细胞顺铂敏感性的影响及其分子机制。
4.利用免疫组织化学法检测453例卵巢癌患者组织中SIRT1表达情况，通过分别对细胞质和细胞核SIRT1表达水平进行半定量评估获得加权分数，统计学分析SIRT1细胞质或细胞核表达状态与患者临床-病理参数和总生存期的关系。通过包埋后胶体金标记透射电子显微镜观察卵巢癌细胞中SIRT1的精确亚细胞定位。
5.通过Transwell实验分析SIRT1亚细胞定位对卵巢癌细胞迁移和侵袭能力的影响。对IGROV1SIRT1细胞和SIRT1NLSmt细胞进行定量蛋白质组学和乙酰化蛋白组学检测，根据结果系统地分析SIRT1细胞和SIRT1NLSmt细胞中蛋白表达水平和乙酰化水平的差异，并通过Westernblot和(或)real-timePCR检测证实特定差异蛋白表达情况，探讨SIRT1亚细胞定位影响卵巢癌细胞迁移侵袭能力的机制。
结果：
1.SIRT1细胞中的外源性SIRT1在细胞核和细胞质内均有分布，SIRT1NESmt细胞中的外源性SIRT1主要位于细胞核，SIRT1NLSmt细胞中的外源性SIRT1主要分布细胞质中。Westernblot和real-timePCR证实上述三种细胞均存在外源性SIRT1的过表达，NESs突变能增加SIRT1NESmt在细胞核中的分布，而NLSs突变可导致SIRT1NLSmt在细胞质中富集。
2.结合p53蛋白表达水平、p53K382乙酰化水平以及定量蛋白质组学和乙酰化蛋白组学结果，提示SIRT1细胞和SIRT1NLSmt细胞中外源性SIRT1具有去乙酰化酶的活性，而SIRT1NESmt细胞因NESs突变导致外源性SIRT1去乙酰化酶活性缺失。
3.与空载体对照组相比，SIRT1细胞对顺铂处理的敏感性增加，而SIRT1NLSmt细胞对于顺铂处理更加耐受。野生型SIRT1和SIRT1NLSmt的过表达均可造成细胞内p62累积和Beclin1减少，提示自噬流的减弱。过表达野生型SIRT1上调卵巢癌细胞Mn-SOD的表达水平，但过表达SIRT1NLSmt缺乏此作用，SIRT1可以与Mn-SOD相互结合，但对Mn-SODK68乙酰化水平没有显著影响。
4.453例卵巢癌患者平均年龄57岁(范围15?92岁)，在患者肿瘤组织中，SIRT1细胞质的高表达与患者更早的FIGO分期(P＜0.001)和更长的总生存期(P=0.047)相关，但SIRT1胞质表达水平不是患者总生存的独立预测因素。SIRT1细胞核表达状态与患者总生存期无相关性。包埋后胶体金免疫电镜法检测显示SIRT1不仅存在于卵巢癌细胞的细胞核，也存在于细胞质基质、粗面内质网和线粒体中。
5.与空载体对照组相比，IGROV1SIRT1NLSmt细胞的迁移和侵袭能力显著降低，而SIRT1细胞的迁移和侵袭能力显著增高。定量蛋白质组学和乙酰化蛋白组学分析显示与SIRT1细胞相比，SIRT1NLSmt细胞的间叶标志物(vimentin和fibronectin)显著下调，上皮标志物(包括细胞角蛋白CK-18和CK-19，桥粒相关蛋白desmoplakin、plakophilin-2、plakophilin-3、periplakin和epiplakin，以及紧密连接功能相关蛋白claudin-1、JAM1和nectin-1)显著上调，并伴随vimentin、CK-18和desmoplakin乙酰化水平的改变。在检测到的差异表达蛋白中，vimentin、fibronectin、CK-18、CK-19、plakophilin-2、plakophilin-3、epiplakin和nectin-1的mRNA水平通过real-timePCR得到确认，CK-18、CK-19和vimentin的蛋白水平通过Westernblot进行了验证。
结论：
1.SIRT1的NESs序列和NLSs序列是影响SIRT1亚细胞定位的关键因素，通过对NESs序列或NLSs序列进行突变，可以获得胞核富集程度更高的SIRT1NESmt和主要定位于细胞质的SIRT1NLSmt。
2.过表达野生型SIRT1的卵巢癌细胞对顺铂处理的敏感性增加，而过表达NLSs突变型SIRT1(SIRT1NLSmt)的细胞对于顺铂处理的耐受性增加，但自噬和Mn-SOD相关机制未能合理解释SIRT1亚细胞定位与卵巢癌顺铂敏感性的关系。
3.卵巢癌患者肿瘤组织中SIRT1细胞质的高表达与患者较好的预后相关。
4.与过表达野生型SIRT1的卵巢癌细胞相比，过表达SIRT1NLSmt的细胞在迁移和侵袭能力上显著降低，其机制与细胞质定位的SIRT1抑制肿瘤细胞的上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)有关。
综上所述，我们的研究首次报道SIRT1的亚细胞定位可以影响卵巢癌细胞的顺铂敏感性以及细胞迁移和侵袭能力，SIRT1的细胞质表达水平与卵巢癌患者的预后相关，这些结果提示SIRT1作为促癌因子或抑癌因子可能与其亚细胞定位有关，为SIRT1在肿瘤耐药和进展中的作用提供了新的思路。
沉默信息调节因子1(Silencinginformation regulator 1, SIRT1)是影响肿瘤发生和进展的重要调节分子，但关于SIRT1在肿瘤(包括卵巢癌)中发挥促癌作用抑或抑癌作用至今仍存在争议。早在十几年前，就有文献报道SIRT1存在核-质穿梭过程，但对于SIRT1的亚细胞定位在卵巢癌中的作用目前仍知之甚少。本研究的目的是探讨SIRT1亚细胞定位对卵巢癌细胞顺铂敏感性和迁移侵袭的影响及其相关机制。
方法：
1.通过构建具有野生型SIRT1、核输出序列(Nuclear Export Sequences，NESs)突变型SIRT1(SIRT1NESmt)和核定位序列(Nuclear Localization Sequences，NLSs)突变型SIRT1(SIRT1NLSmt)编码序列的慢病毒载体，转染人类卵巢癌IGROV1细胞和HEY细胞，通过筛选获得过表达野生型SIRT1、NESs突变型SIRT1和NLSs突变型SIRT1的卵巢癌稳定转染细胞株(以下简称为SIRT1细胞、SIRT1NESmt细胞和SIRT1NLSmt细胞)。
2.通过观察慢病毒载体编码的SIRT1-GFP融合蛋白的荧光定位，明确稳定转染细胞中外源性SIRT1的亚细胞定位。利用real-timePCR、Westernblot法对分离提取的核-质蛋白进行检测，证实外源性SIRT1的表达和亚细胞定位情况。通过Westernblot法检测稳定转染细胞株中已知SIRT1对p53去乙酰化作用的特异性靶位点K382的乙酰化水平，结合定量蛋白质组学和乙酰化蛋白组学检测比较IGROV1各组稳定转染细胞株中蛋白和赖氨酸残基乙酰化的整体改变水平，推测外源性SIRT1的去乙酰化酶活性。
3.使用CCK-8细胞毒性实验和流式细胞术比较顺铂处理后IGROV1和HEY各组稳定转染细胞之间的存活和凋亡情况。通过Westernblot法和超氧化物歧化酶分型检测试剂盒检测自噬相关蛋白的表达、Mn-SOD表达水平、Mn-SODK68位乙酰化水平及其酶活性，结合免疫共沉淀法探讨Mn-SOD与SIRT1的相互结合作用，以期发现SIRT1亚细胞定位对卵巢癌细胞顺铂敏感性的影响及其分子机制。
4.利用免疫组织化学法检测453例卵巢癌患者组织中SIRT1表达情况，通过分别对细胞质和细胞核SIRT1表达水平进行半定量评估获得加权分数，统计学分析SIRT1细胞质或细胞核表达状态与患者临床-病理参数和总生存期的关系。通过包埋后胶体金标记透射电子显微镜观察卵巢癌细胞中SIRT1的精确亚细胞定位。
5.通过Transwell实验分析SIRT1亚细胞定位对卵巢癌细胞迁移和侵袭能力的影响。对IGROV1SIRT1细胞和SIRT1NLSmt细胞进行定量蛋白质组学和乙酰化蛋白组学检测，根据结果系统地分析SIRT1细胞和SIRT1NLSmt细胞中蛋白表达水平和乙酰化水平的差异，并通过Westernblot和(或)real-timePCR检测证实特定差异蛋白表达情况，探讨SIRT1亚细胞定位影响卵巢癌细胞迁移侵袭能力的机制。
结果：
1.SIRT1细胞中的外源性SIRT1在细胞核和细胞质内均有分布，SIRT1NESmt细胞中的外源性SIRT1主要位于细胞核，SIRT1NLSmt细胞中的外源性SIRT1主要分布细胞质中。Westernblot和real-timePCR证实上述三种细胞均存在外源性SIRT1的过表达，NESs突变能增加SIRT1NESmt在细胞核中的分布，而NLSs突变可导致SIRT1NLSmt在细胞质中富集。
2.结合p53蛋白表达水平、p53K382乙酰化水平以及定量蛋白质组学和乙酰化蛋白组学结果，提示SIRT1细胞和SIRT1NLSmt细胞中外源性SIRT1具有去乙酰化酶的活性，而SIRT1NESmt细胞因NESs突变导致外源性SIRT1去乙酰化酶活性缺失。
3.与空载体对照组相比，SIRT1细胞对顺铂处理的敏感性增加，而SIRT1NLSmt细胞对于顺铂处理更加耐受。野生型SIRT1和SIRT1NLSmt的过表达均可造成细胞内p62累积和Beclin1减少，提示自噬流的减弱。过表达野生型SIRT1上调卵巢癌细胞Mn-SOD的表达水平，但过表达SIRT1NLSmt缺乏此作用，SIRT1可以与Mn-SOD相互结合，但对Mn-SODK68乙酰化水平没有显著影响。
4.453例卵巢癌患者平均年龄57岁(范围15?92岁)，在患者肿瘤组织中，SIRT1细胞质的高表达与患者更早的FIGO分期(P＜0.001)和更长的总生存期(P=0.047)相关，但SIRT1胞质表达水平不是患者总生存的独立预测因素。SIRT1细胞核表达状态与患者总生存期无相关性。包埋后胶体金免疫电镜法检测显示SIRT1不仅存在于卵巢癌细胞的细胞核，也存在于细胞质基质、粗面内质网和线粒体中。
5.与空载体对照组相比，IGROV1SIRT1NLSmt细胞的迁移和侵袭能力显著降低，而SIRT1细胞的迁移和侵袭能力显著增高。定量蛋白质组学和乙酰化蛋白组学分析显示与SIRT1细胞相比，SIRT1NLSmt细胞的间叶标志物(vimentin和fibronectin)显著下调，上皮标志物(包括细胞角蛋白CK-18和CK-19，桥粒相关蛋白desmoplakin、plakophilin-2、plakophilin-3、periplakin和epiplakin，以及紧密连接功能相关蛋白claudin-1、JAM1和nectin-1)显著上调，并伴随vimentin、CK-18和desmoplakin乙酰化水平的改变。在检测到的差异表达蛋白中，vimentin、fibronectin、CK-18、CK-19、plakophilin-2、plakophilin-3、epiplakin和nectin-1的mRNA水平通过real-timePCR得到确认，CK-18、CK-19和vimentin的蛋白水平通过Westernblot进行了验证。
结论：
1.SIRT1的NESs序列和NLSs序列是影响SIRT1亚细胞定位的关键因素，通过对NESs序列或NLSs序列进行突变，可以获得胞核富集程度更高的SIRT1NESmt和主要定位于细胞质的SIRT1NLSmt。
2.过表达野生型SIRT1的卵巢癌细胞对顺铂处理的敏感性增加，而过表达NLSs突变型SIRT1(SIRT1NLSmt)的细胞对于顺铂处理的耐受性增加，但自噬和Mn-SOD相关机制未能合理解释SIRT1亚细胞定位与卵巢癌顺铂敏感性的关系。
3.卵巢癌患者肿瘤组织中SIRT1细胞质的高表达与患者较好的预后相关。
4.与过表达野生型SIRT1的卵巢癌细胞相比，过表达SIRT1NLSmt的细胞在迁移和侵袭能力上显著降低，其机制与细胞质定位的SIRT1抑制肿瘤细胞的上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)有关。
综上所述，我们的研究首次报道SIRT1的亚细胞定位可以影响卵巢癌细胞的顺铂敏感性以及细胞迁移和侵袭能力，SIRT1的细胞质表达水平与卵巢癌患者的预后相关，这些结果提示SIRT1作为促癌因子或抑癌因子可能与其亚细胞定位有关，为SIRT1在肿瘤耐药和进展中的作用提供了新的思路。