论文部分内容阅读
目的(1)探索左旋多巴(L-DOPA)作用于马尔尼菲篮状菌(Talaromyces marneffei,TM)后其产黑素的菌株较不产黑素的菌株蛋白表达有何差异。(2)对差异蛋白结果进行生物信息学的分析,了解差异蛋白所富集的主要生物学通路,对黑素产生时的细胞内部生物学过程有初步的了解。(3)选取感兴趣的差异蛋白点进一步分析,希望发掘治疗马尔尼菲篮状菌感染潜在的药物治疗靶点。方法(1)在含L-DOPA及不含L-DOPA的ANM固体培养基上避光培养Frr2161,37℃7天。(2)菌体蛋白通过Novagen的Yeast Buster proteins extraction reagent进行提取,并用2-D Quant-kit试剂盒进行蛋白定量。(3)利用双向凝胶电泳分离总蛋白,银染显色后用ImageMaster 2D platinum 5.0分析软件对胶图进行分析,找到差异蛋白点。(4)通过基质辅助激光解析/电离-飞行时间串联质谱(MALDI-TOF/TOF MS)获取肽质量指纹谱,利用MASCOT搜库(UniProt数据库)鉴定出差异蛋白点。(5)将鉴定出的差异蛋白进行GO和pathway的分析。(6)利用RT-qPCR对感兴趣的蛋白进行验证。(7)在含格尔德霉素与不含格尔德霉素的BHI培养基上培养TM,通过肉眼、荧光显微镜及透射电镜观察格尔德霉素对TM有何影响。结果(1)经双向凝胶电泳分离总蛋白后总共得到38个差异蛋白点,其中在产黑素的TM中高表达的蛋白点15个,新出现的蛋白点16个,低表达的蛋白点7个。(2)蛋白质谱分析显示差异蛋白组富集在HSP家族,尤其是HSP90。(3)RT-qPCR的结果显示HSP90、HSP60、HSP70 mRNA水平在L-DOPA黑素化培养的TM中表达上调,与蛋白组学比较结果一致。(4)GO分析提示热休克蛋白家族富集在了绝大部分的生物学功能,热休克蛋白主要富集在压力应激、细胞加工、蛋白质折叠、生物学进程、对刺激的反应这几条通路而这些通路同样是差异蛋白富集较多的通路,pathway分析提示蛋白富集最多的是吞噬体这条通路。(5)在含格尔德霉素的BHI培养基上,肉眼见TM菌落生长受到抑制,黑素生成减少;荧光显微镜结果见TM形态有向菌丝相转化的趋势,透射电镜结果见菌体内电子致密颗粒较不含格尔德霉素的对照组明显减少,囊泡未见明显扩张,细胞壁破坏。结论:(1)热休克蛋白家族尤其是HSP90在TM黑素产生过程中有着活跃的生物学活动。(2)HSP90抑制剂对TM生长和黑素生成有抑制作用。(3)黑素的代谢通路与吞噬体通路密切相关。