论文部分内容阅读
无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)是唯一拥有B群特异性抗原的链球菌，也是一种人畜共患、传染性极强的的病原菌。近年来，由无乳链球菌感染罗非鱼引起的链球菌病，由于其发病快，死亡率高，且疾病一旦爆发很难控制，使其严重危害罗非鱼养殖业的健康发展，并给全球罗非鱼的养殖业带来了巨大的经济损失。RovS转录调节因子属于Rgg家族，是无乳链球菌中一个重要的调节因子，能够在转录上调控细菌基因组中多个基因的表达，同时还能够与细菌中其他调控系统协同作用，调控细菌的生长、繁殖及代谢等生命活动。本研究以罗非鱼源无乳链球菌ZQ0910 RovS转录调节因子为研究对象，通过构建rovS基因缺失突变株，比较野生株和突变株的生物学性状，研究其致病力及相关毒力因子的表达情况，为进一步探讨罗非鱼源无乳链球菌的分子致病机理奠定了理论基础。 利用PCR技术扩增rovS基因上下游同源片段rovS-F、rovS-R，以及红霉素抗性基因Erm，然后利用温度敏感型自杀载体pSET4s构建重组质粒pSET4s-rF-Erm-rR，通过电转化的方法将重组质粒转入野生株S.agalactiae ZQ0910中，通过抗生素（Spc+，100μg·mL-1。Erm+，50μg·mL-1）及温度双重标记筛选rovS基因缺失突变株，并将其命名为ΔrovS。 在相同的培养条件下，通过细菌的传代培养，对野生株S.agalactiae和突变株ΔrovS的遗传稳定进行分析，结果显示，突变株ΔrovS能够稳定的生长。通过测定OD600绘制的野生株和突变株的生长曲线发现，突变株ΔrovS比野生株S.agalactiae的生长略为缓慢。革兰氏染色结果显示，rovS基因的缺失并未对细菌的革兰氏染色产生影响。通过观察血琼脂平板上野生株和突变株的生长形态发现，突变株ΔrovS菌落周围不产生β-溶血环，说明rovS基因的缺失改变了细菌的溶血性。半致死量LD50测定结果显示，突变株ΔrovS的LD50(3.16×106 cfu)是野生株LD50(2.0×107cfu)的6倍，说明rovS基因的缺失使无乳链球菌对罗非鱼的致病性减弱。利用实时荧光定量PCR技术，研究无乳链球菌毒力相关因子mRNA表达量的差异，结果显示无乳链球中rovS基因的缺失，使得fbsA和sip基因的表达水平上调，gluC、gyrA、hlyA、pyrR及sodA基因的表达水平下调，ccpA、cpsC和scpB基因的表达水平并无明显变化。