本研究包括三部分内容，分述如下：　　目的：　　第一部分鉴定miR-7基因敲减小鼠模型，为进一步深入研究miR-7的生物学功能奠定基础。　　第二部分研究miR-7基因敲减对小鼠胸腺细胞发育的影响。　　第三部分探讨miR-7基因敲减影响小鼠胸腺细胞发育的机制。　　方法：　　第一部分　　1.常规剪取7只miR-7基因敲减(miR-7 knock down，miR-7KD)小鼠的脚趾和尾巴，按照DNA试剂盒说明书以及Trizol法分别提取其基因组DNA和总RNA。剪取1只WT(wild-type，WT)小鼠的尾巴，Trizol法提取其总RNA，并将其作为阴性对照。将提取的两组小鼠的总RNA分别逆转录成cDNA。然后，以基因组DNA和cDNA为模板，利用miR-7-sponge真核表达载体特异性引物，采取PCR技术扩增目的基因片段—增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)。　　2.提取WT和miR-7KD小鼠的心脏、肝脏以及脾脏等7个不同组织器官的总RNA，用miR-7特异性引物逆转录成cDNA，利用Real-time PCR探针法检测各组织器官中miR-7成熟体的表达水平。　　3.观测并记录两组小鼠从2周到12周以内的体重变化以及从出生到24周以内的总生存率。　　4. HE染色观察第13周的miR-7KD小鼠心脏、肺脏、肝脏以及肾脏的形态学结构改变。　　第二部分　　1.检测miR-7KD小鼠较WT小鼠胸腺大小、重量以及细胞总数的变化。　　2.利用原位杂交技术以及 Real-time技术检测miR-7KD小鼠胸腺miR-7的表达水平。　　3. HE染色观察miR-7KD小鼠胸腺的形态学结构改变。　　4.采用流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）检测胸腺T细胞各亚群的比例变化；并进一步检测其细胞活化分子CD44、CD62L以及CD69的比例。　　5.利用核抗原Ki67染色法和PI法检测胸腺各细胞亚群的增殖以及凋亡比例。　　6. TCR特异性信号以及PMA和离子霉素体外诱导胸腺细胞，观察细胞增殖的变化。　　7.通过FCM检测miR-7KD小鼠胸腺各细胞亚群中细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17以及RORγt的比例变化。　　第三部分　　1.常规提取小鼠胸腺单细胞悬液，Trizol法提取其RNA，送上海康成生物公司进行NimbleGen Gene Expression Profile检测。然后，根据基因表达谱芯片结果，我们进行差异基因GO（Gene Ontology）分析和与T细胞增殖相关信号通路分析。GO分析包括三个方面：生物过程（Biological Process），细胞组成（Cellular Component）和功能分子（Molecular Function）。信号通路分析主要分析与T细胞增殖活性相关信号通路的关键分子在RNA表达水平上的差异。　　2.依据基因表达谱芯片结果，通过靶基因预测软件并结合相关文献报道预测miR-7在胸腺细胞中的潜在靶标。　　3. Real-time PCR技术检测潜在靶基因的表达水平。　　4. Western Blot技术检测胸腺蛋白中总ERK1/2和磷酸化-ERK1/2表达的改变。　　结果：　　第一部分　　1. PCR结果显示，除WT小鼠外，模型小鼠的脚趾基因组DNA以及鼠尾cDNA中均能扩增出目的基因片段-EGFP。　　2. Real-time PCR结果显示，miR-7KD小鼠心脏、肝脏以及脾脏等7个重要组织器官中miR-7成熟体的表达水平较WT小鼠均显著下调（P<0.05）。　　3.从第2周到第12周内，miR-7KD小鼠较WT小鼠体重显著降低，体积明显减小，且24周内死亡率明显增加（P<0.05）。　　4. HE染色结果显示，miR-7KD小鼠心脏、肺脏、肝脏以及肾脏形态学结构发生了明显的病理性改变。　　第二部分　　1.与 WT小鼠相比，miR-7KD小鼠胸腺大小、重量以及细胞总数均显著减少（P<0.05）。　　2.原位杂交与RT-PCR结果显示，miR-7KD小鼠较WT小鼠胸腺中miR-7成熟体的表达水平显著降低（P<0.05）。　　3. HE染色结果显示miR-7KD小鼠胸腺形态学结构发生了明显的病理性改变。　　4. FCM结果显示，miR-7KD小鼠胸腺 CD4+单阳性细胞（CD4+ single positive，CD4+SP）以及 CD8+单阳性细胞(CD8+ single positive，CD8+SP）比例明显降低（P<0.05），然而CD4+CD8+双阳性细胞（CD4+CD8+double positive，CD4+CD8+DP）比例无显著改变。进一步的FCM结果显示，与 WT小鼠相比，miR-7KD小鼠胸腺CD4+SP以及 CD8+SP细胞中 CD44、CD62L以及 CD69阳性比例均显著增加（P<0.05），且其Ki67以及PI的阳性率也明显上调（P<0.05）。　　5. Anti-CD3/CD28协同刺激胸腺细胞，并于24h、48h以及72h时分别观察细胞增殖变化，结果显示miR-7KD小鼠较WT小鼠胸腺细胞增殖能力均明显下调（P<0.05）。同样，PMA与离子霉素体外共刺激胸腺细胞6h后的增殖结果显示与anti-CD3/CD28刺激结果是一致的。　　6. FCM结果显示，miR-7KD小鼠胸腺中 CD4+SP以及 CD8+SP细胞中细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17以及RORγt的表达水平显著上调（P<0.05）。　　第三部分　　1.基因芯片结果显示，WT小鼠与miR-7KD小鼠的胸腺细胞中存在许多基因表达差异。并且，其中一些与T细胞增殖活性相关的信号通路关键分子的表达在RNA水平上也存在显著差异性。　　2.推测出Smad5与Snap23为miR-7在胸腺细胞中潜在作用靶标。　　3. RT-PCR结果显示，与WT小鼠相比，miR-7KD小鼠胸腺细胞中Smad5以及Snap23的表达水平明显增加（P<0.05）。　　4. miR-7KD小鼠胸腺中总 ERK1/2以及磷酸化-ERK1/2的表达水平均明显下调（P<0.05）。　　结论：　　第一部分　　1.我们成功鉴定了miR-7基因敲减小鼠模型。　　2. miR-7敲减后，小鼠生长发育迟缓，死亡率增加，且多个重要组织器官发生病理学改变。　　第二部分　　1. miR-7基因敲减后，可显著影响胸腺T淋巴细胞的发育。　　第三部分　　1. miR-7敲减影响胸腺细胞发育可能与靶分子Smad5和Snap23的表达上调有关。　　2. miR-7可能通过ERK信号途径调控胸腺细胞的发育过程。