【摘 要】
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人工授精已经广泛应用于现代养猪生产。99%以上的猪人工授精采用的是常温（15-25℃）液态保存1～5天的精液;其中,常温保存1～2天的精液约占85%。猪精液常温保存通过添加不同成分（抗生素、糖类、抗氧化剂以及精子刺激物等）来抑制精子代谢、减缓精子运动、减少能量消耗从而达到长期保存的目的。因此,如何长期保存公猪精子并维持其正常的活力和受精能力已成为当前公猪生产中亟待解决的关键问题。精子的代谢活动是精
【基金项目】
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国家自然科学基金（31570533,30901028）； 国家自然科学基金（31872356）miR-26a/PDHX甲基化模式对猪精子代谢和活力的影响（2018.01-2021.12）；
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人工授精已经广泛应用于现代养猪生产。99%以上的猪人工授精采用的是常温（15-25℃）液态保存1～5天的精液;其中,常温保存1～2天的精液约占85%。猪精液常温保存通过添加不同成分（抗生素、糖类、抗氧化剂以及精子刺激物等）来抑制精子代谢、减缓精子运动、减少能量消耗从而达到长期保存的目的。因此,如何长期保存公猪精子并维持其正常的活力和受精能力已成为当前公猪生产中亟待解决的关键问题。精子的代谢活动是精子维持生命,运动和受精能力的基础。然而,有关猪精子在体外常温液态保存过程中的代谢机制尚不清楚,精子的代谢途径也存在一定争议。因此,本试验以体外常温液态保存猪精子为研究对象,通过添加不同浓度葡萄糖、乳酸、丙酮酸等外源物质,以及氧化磷酸化抑制剂（鱼藤酮、CCCP）和糖酵解途径抑制剂（碘乙酸钠）,检测这些精子能量代谢底物及代谢抑制剂对精子代谢、运动相关指标及代谢相关m RNA和miRNA的影响,为进一步揭示猪精子体外常温液态保存过程中的代谢途径、提高猪精液体外常温液态保存效果等提供理论依据。主要结果如下:（1）在猪精子常温液态保存过程中,研究添加不同浓度葡萄糖、乳酸和丙酮酸对猪精子质量的影响。结果表明,添加5m M葡萄糖组、3 m M乳酸组和5 m M丙酮酸组的质膜完整性（PMI）、线粒体膜电位（MMP）、ATP含量和精子运动速度（CASA）均显著高于对照组（p＜0.05）。在以无Ca2+、Mg2+的PBS为基础液的精液常温保存液中分别添加浓度为5m M葡萄糖、3 m M乳酸组和5 m M丙酮酸组时,保存效果最佳。（2）双荧光素酶报告系统试验结果表明,PGAM1是miR-1343的直接靶基因。在猪精子中,miR-1343通过靶控PGAM1基因,控制磷酸甘油酸变位酶催化3-磷酸甘油酸和2-磷酸甘油酸之间的相互转换,从而参与精子糖代谢过程。（3）猪精子常温液态保存过程中,在稀释液中添加氧化磷酸化抑制剂（鱼藤酮,CCCP）和糖酵解抑制剂（碘乙酸钠）处理后,公猪精子ATP含量和运动速度均显著低于添加糖酵解抑制剂（碘乙酸钠）（p＜0.05）。结果表明,公猪精子在体外常温液态保存过程中,主要依靠氧化磷酸化途径提供能量维持精子的运动和代谢。（4）在常温液态保存过程中,检测添加5 m M葡萄糖对猪精子代谢途径中miR-26a/PDHX和miR-1343/PGAM1基因表达的影响。结果表明,5 m M葡萄糖组的PDHX和PGAM1的相对表达水平均显著高于对照组（p＜0.05）;而miR-26a和mir-1343的相对表达均显著低于对照组（p＜0.05）。添加代谢抑制剂孵育24小时后,RT-qPCR结果显示鱼藤酮组和CCCP组PDHX和PGAM1的表达水平均显著高于对照组（p＜0.05）;miR-26a和miR-1343的相对表达水平显著低于对照组（p＜0.05）。碘乙酸钠组中PDHX和PGAM1的表达水平显著低于对照组（p＜0.05）,而miR-26a和miR-1343的相对表达水平显著高于对照组（p＜0.05）。以上结果表明,在猪精子体外常温液态保存过程中,精子的糖酵解和氧化磷酸化代谢途径受到miR-26a/PDHX和miR-1343/PGAM1的调节。综上所述,在以无Ca2+、Mg2+的PBS为基础液的精液常温保存液中分别添加5 m M葡萄糖、3 m M乳酸和5 m M丙酮酸时,保存效果最佳;猪精子在体外常温液态保存条件下主要能量来源是依靠氧化磷酸化途径。
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