猪链球菌是一种重要的人畜共患致病性病原菌,可以导致宿主出现化脓性脑膜炎、败血症、心内膜炎、肺炎和关节炎等,到目前为止,已经发现了33个血清型(1-31,33,和1/2)。2005年夏天,以四川资阳为中心,爆发了大规模的猪链球菌疫情,死亡猪只647头,共有215人遭受感染,其中38人死亡。这些人猪链球菌疫情将猪链球菌的公共卫生意义提升到一个新高度。本研究系统分析了猪链球菌在我国猪链球菌病中的重要性、相关毒力因子及基因型与致病力的关系。猪血浆中的主要成分血纤维蛋白原能够诱导猪链球菌形成生物被膜,病原菌形成生物被膜是病原菌致病的一种机制,通过形成生物被膜,细菌变成持续性感染,抵抗宿主先天性和特异性免疫系统的清除,帮助细菌抵抗抗生素的杀害。本研究发现生物被膜形成能力的菌株对比相同基因型的菌株的毒力减弱。通过生物芯片对猪链球菌生物被膜形成后的转录组与未形成生物被膜的转录组进行了比较分析,发现并验证了两个与生物被膜和致病力相关的基因。现将主要研究结果报告如下：1.我国猪链球菌分子流行病学相关研究通过系统的流行病学分析调查,2003-2007年间,在全国共分离到407株猪链球菌,占分离的猪源链球菌总数的56.6%,已经取代马链球菌兽疫亚种成为我国猪链球菌病的主要病原。在这些猪链球菌中,血清2型占43.2%,3型占14.7%,其次为4,8,5,7,1/2型(3.2%-6.4%)。2型和系统感染显著相关,3型和肺炎型病例显著相关。54%的2型菌株属于基因型sly+mrp+epf+,这种基因型通过小鼠感染试验证实与高毒力显著相关。继续对2008-2009年间的流行病学调查表明,2型猪链球菌无论是在肺炎型病例还是在系统感染病例中的比例始终最高。3型猪链球菌的在肺炎型病例中的重要性已经下降,21型有上升趋势,2型猪链球菌已经成为我国猪链球菌病的主要血清型。通过四环素抗性基因种类分析和MLST分型,我国爆发的人猪链球菌菌株在这些2型链球菌中仅少量存在。我国分离菌株大部分处于毒力强的ST1和ST27complex中,且存在一部分超强毒力ST1和ST7型的菌株,且这些菌株在不断发生演化。外周血吞噬实验结果提示猪链球菌的抗吞噬能力与ST型密切相关。ST1相关菌株最强,ST7, ST27 complex的菌株其次,其他ST型菌株最弱。最后,为了快速对这些猪链球菌进行MLST鉴定进行流行病学分析,建立了核酸质谱分型方法,该方法完成分析仅需要6.5小时,为快速对猪链球菌进行分型奠定基础。2.猪链球菌生物被膜形成菌株的初步应用从大量的临床分离株中发现了一株具有生物被膜形成能力,基因型sly+mrp+epf+的低毒力2型猪链球菌菌株。实验证明该株菌对猪具有很强的免疫原性,用该菌免疫猪后能够抵抗2型强毒的攻击,但是对仔猪的安全剂量为5000万。因此,为了保留其免疫原性,进一步提高此菌株的安全性,继续对该菌的芳香族氨基酸合成相关基因aroC基因进行缺失。结果表明：突变株在未补加芳香簇氨基酸的培养基中生长速度显著下降,但是当培养基中添加三种芳香簇氨基酸后,其生长速度回复。为检测其安全性和免疫效力,用1亿和10亿两个剂量组分别免疫仔猪,免后第二周检测抗体同时攻毒。两个剂量组免疫后安全性良好。第二次免疫后第二周,用2型猪链球菌荚膜多糖包被ELISA板测定抗体水平显著上升。攻毒保护实验结果表明对照组在第3天全部死亡,1亿免疫剂量组2/4保护,保护率50%。10亿免疫剂量组3/4保护,保护率75%。取免疫保护组和对照组攻毒后的组织(脑,肺,心肌,脾脏)进行病理切片分析其病理变化,结果表明：对照组对比免疫保护组,存在明显的脑神经元坏死,心肌出血,脾坏死。对照组比免疫保护组的肺组织存在更严重的肺不张。3.猪链球菌生物被膜形成机制初步探讨及新的毒力相关基因发掘通过比较普通培养基和添加纤维蛋白原的培养基中培养的猪链球菌转录组的差异来探讨猪链球菌形成生物被膜的机制。(1)结果显示,共有648个基因的表达差异在两倍以上。其中330个基因表达下调,318个基因表达上调。生物被膜形成的过程中由于周围营养物质的浓度降低,细菌的生长开始延缓,相应的细菌的代谢速度降低,大量蛋白质合成相关基因,核糖体结构蛋白相关基因,氨基酸合成与转运相关基因,糖类转运和代谢相关基因,DNA复制相关基因下调表达。另一方面,细菌通过生物被膜形成,下调表达细胞壁和荚膜多糖合成相关基因,上调表达菌毛输出相关基因和Sortase基因,溶血素相关基因等,这些基因的上调表达为猪链球菌在宿主黏附定植从而建立感染。(2)对上调表达幅度较大的两个基因leuD和autolysin基因继续深入研究。通过定量PCR发现,leuD基因在生物被膜形成过程中转录上调200倍,与芯片结果趋势一致。Autolysin也存在一定程度的上调表达,暗示这两个基因与生物被膜形成密切相关。继续构建突变体和回复突变体验证其功能,结果表明两个基因对生物被膜形成能力,对Hep-2细胞的黏附和毒力,对猪肺上皮细胞SJPLC细胞系的毒力都显著下降。最后,猪外周血细胞吞噬试验证明：autolysin突变株的存活能力相对于野生株的存活能力平均下降89.3%,leuD突变株的存活能力相对于野生株的存活能力平均下降66.81%,autolysin和leuD基因的缺失可以显著降低猪链球菌对外周血细胞吞噬的抵抗能力。对小鼠的毒力试验表明,autolysin突变株对小鼠的半数致死量(LD50)上升2.36倍。leuD基因突变株对小鼠的半数致死量(LD50)上升1.65倍,表明autolysin和leuD对小鼠的毒力具有一定的影响。