背景和目的食管癌是最常见的消化道肿瘤之一,其发生率在全球范围内居第八位,死亡率占第六位。根据组织学类型,食管癌主要分为食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC)。在我国,食管鳞癌作为主要的组织学类型其致死性高,预后差,5年生存率低,并具有明显的地域分布差异。目前食管鳞癌的主要治疗手段包括手术、放疗、化疗等,对于晚期与转移性的食管鳞癌患者,化疗仍然是延长患者生存期与改善患者预后最主要的治疗手段,但耐药性和毒性是导致化疗失败的主要原因,因此寻找一种新的有效的预防、诊断和治疗食管鳞癌患者的策略显得越来越重要。四硫代钼酸铵(ammonium tetrathiomolybdate,TM)是人类所必须的微量元素钼的化合物之一,可以与铜离子、血液中的清蛋白形成高亲和力的三元复合物,能螯合血液中游离的铜离子,降低体内铜的含量。在多种肿瘤研究中发现,TM具有减少血管生成、抑制肿瘤生长和远端转移、促进肿瘤坏死等作用。研究表明,TM通过靶向铜转运相关蛋白增强妇科肿瘤(如乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌等)对顺铂的敏感性,减少化疗中产生的耐药性,进一步提高其抗肿瘤效果。顺铂是目前临床上用于治疗多种恶性肿瘤最广泛的一线标准化疗药物,包括宫颈癌、卵巢癌、头颈部癌、肺癌、胃肠道癌、乳腺癌、食管癌等。然而,顺铂产生的副作用及神经毒性,使其使用剂量与药效都受到了严重的限制,因而如何降低其治疗剂量并增强其抗肿瘤效果以及阐明其耐药的分子机制成为目前研究的热点。研究表明,信号转导子和转录激活子(Signal transducers and activators of transcription 3,Stat3)信号途径参与多种肿瘤的发生、发展过程,并成为肿瘤有效的治疗靶点。后来陆续的研究显示,Stat3信号途径与多种肿瘤的耐药关系密切,该途径的活化是介导肿瘤耐药极其重要的信号途径之一。是否TM联合顺铂发挥抗肿瘤作用与Stat3信号途径的活化有关?这将成为本课题探讨的方向。因此,本课题首先通过细胞增殖实验、流式细胞术、迁移和侵袭相关实验以及转录组学阐明TM在食管鳞癌中的抗肿瘤作用及其可能的分子机制;进一步探讨将TM与顺铂联合的协同抗肿瘤作用及其分子机制。该研究为TM在未来临床上治疗食管鳞癌患者奠定理论基础。第一部分四硫代钼酸铵体外抗食管鳞癌细胞的作用及其分子机制方法1.CCK-8实验检测不同浓度的TM(0、5、10、20、30、50、80、100、150和200μM),在不同时间点(24、48、72和96h)对食管鳞癌细胞(EC1、Eca109、EC9706、TE1)增殖能力的影响。2.采用流式细胞术分别检测不同浓度的TM在48h对食管鳞癌细胞周期和凋亡的影响。Hoechst染色检测不同浓度的TM在48h对食管鳞癌细胞凋亡的影响。3.细胞划痕和Transwell小室检测不同浓度的TM对食管鳞癌细胞迁移和侵袭能力的影响。4.Affymetrix基因芯片表达谱分析TM对食管鳞癌细胞Eca109转录表达谱的影响。Western blot检测不同浓度的TM在48h对食管鳞癌细胞周期、凋亡和侵袭相关蛋白水平的表达变化,同时验证芯片表达结果中关键的非受体酪氨酸激酶c-Abl的表达变化。5.统计学处理:实验数据采用GraphPad Prism 6.0统计学软件进行分析处理。对于多个样本采用One-way ANOVA分析,两个样本采用独立样本t检验,P<0.05表示具有统计学差异。结果1.CCK-8结果表明,不同浓度的TM均能抑制食管鳞癌细胞的增殖活性,随时间的延长,抑制效果越明显。2.细胞周期结果表明,不同浓度的TM均能阻滞食管鳞癌细胞周期在S期;Western blot结果显示,TM显著下调食管鳞癌细胞中细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4与细胞周期素Cyclin D1、Cyclin A蛋白的表达水平。3.细胞凋亡结果表明,不同浓度的TM均能显著增加食管鳞癌细胞凋亡的细胞数,且TM浓度越大,凋亡细胞数越多;进一步Hoechst染色结果显示,TM能够诱导食管鳞癌细胞凋亡。此外,Western blot结果显示,TM显著促进食管鳞癌细胞中细胞凋亡相关蛋白cleaved-caspase3、p-PARP和促凋亡蛋白Bax的表达,抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表达。4.在48h和72h,不同浓度的TM均能显著抑制食管鳞癌细胞的迁移;此外,Transwell小室结果表明,不同浓度的TM能显著抑制食管鳞癌细胞的侵袭能力。Western blot结果表明,TM显著下调食管鳞癌细胞中金属基质蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达。5.Affymetrix基因芯片表达谱结果显示,TM能够激活或抑制食管鳞癌Eca109细胞中多种信号途径,其中包括下调Eca109细胞中c-Abl基因mRNA的水平;Western blot实验进一步证实不同浓度的TM均能显著下调食管鳞癌细胞中c-Abl蛋白的表达。第二部分四硫代钼酸铵通过抑制Stat3途径增强食管鳞癌细胞对顺铂的敏感性方法1.CCK-8实验检测不同浓度的顺铂(0、0.5、1、2、5、8、10、20和50μg/ml)在不同时间点(24h、48h、72h和96h)对食管鳞癌细胞(EC1、Eca109、EC9706和TE1)增殖能力的影响;以及TM联合不同浓度的顺铂(0、1、2、5和10μg/ml)对食管鳞癌细胞增殖活性的影响。2.流式细胞术和Transwell小室分别检测TM联合顺铂在48h对食管鳞癌细胞凋亡和侵袭能力的影响。3.Western blot检测TM联合顺铂以及TM、顺铂和IL-6共同处理食管鳞癌细胞48h,Stat3和p-Stat3蛋白表达水平的变化。并且采用CCK-8实验检测TM/顺铂/IL-6共同处理对食管鳞癌细胞增殖能力的影响。4.裸鼠移植瘤实验:皮下接种食管鳞癌细胞EC9706,设生理盐水组、单独TM治疗组、单独顺铂治疗组和TM联合顺铂治疗组,每周2次测定肿瘤体积,并采用GraphPad Prism 6.0软件汇制肿瘤生长曲线。当测量结束后,剥离肿瘤组织,做石蜡包埋组织切片,采用免疫组织化学检测血管生成相关蛋白VEGF、CD31和ERG的表达以及总的Stat3、p-Stat3和Ki-67的表达。5.统计学处理:实验数据采用GraphPad Prism 6.0统计学软件进行分析处理,对于多个样本采用One-way ANOVA分析,两个样本采用独立样本t检验,P<0.05表示具有统计学差异。结果1.CCK-8结果显示,不同浓度的顺铂均能显著抑制食管鳞癌细胞的增殖活性,随时间的延长,其抑制效果逐渐增加;TM能显著增强顺铂对食管鳞癌细胞增殖的抑制效果。2.流式细胞术结果表明,与未处理组或单独处理组相比,TM联合顺铂能显著诱导食管鳞癌细胞凋亡;Transwell小室结果显示,与未处理组或单独处理组相比,TM联合顺铂显著抑制食管鳞癌细胞的侵袭能力。3.Western blot结果表明,TM联合顺铂显著下调食管鳞癌细胞中p-Stat3蛋白的表达水平,而对总的Stat3的蛋白表达无影响。IL-6能够逆转TM联合顺铂组中食管鳞癌细胞中p-Stat3蛋白表达的降低,进一步的CCK-8实验结果表明,IL-6介导的Stat3的活化能够逆转TM联合顺铂介导的食管鳞癌细胞的抑制效应。4.裸鼠皮下移植瘤实验显示,与生理盐水组、单独TM治疗组、单独顺铂治疗组相比,TM联合顺铂治疗显著抑制裸鼠移植瘤的生长。免疫组织化学结果表明,TM联合顺铂治疗能降低肿瘤组织中血管生成相关蛋白VEGF、CD31和ERG的表达水平,并抑制p-Stat3的活化,降低Ki-67的表达。结论1.TM能引发食管鳞癌细胞的增殖抑制、S期阻滞、细胞凋亡以及迁移和侵袭能力的降低,表明TM可能成为抗食管鳞癌潜在的治疗制剂。2.TM能从体内外增强顺铂的抗肿瘤效果,提示TM有望成为临床上顺铂治疗食管鳞癌患者的辅助药物。3.TM联合顺铂治疗能显著下调血管生成相关蛋白VEGF、CD31和ERG的表达,降低p-Stat3和Ki-67蛋白的表达,因而有望成为临床上评价顺铂耐药极其重要的分子靶点。