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目的:研究CXC195在体外诱导HepG2细胞凋亡并抑制细胞增殖。探讨PI3K-AKT-mTOR信号通路和内质网应激共同诱导HepG2细胞凋亡。为CXC195治疗肝癌提供帮助。材料和方法:体外培养HepG2细胞株作为实验组,对照组使用L-02细胞株。化学反应合成CXC195。联合台盼蓝拒染法和MTT比色法检测CXC195分别作用HepG2细胞和L-02细胞后细胞的存活情况,流式细胞术分析细胞凋亡,检测浓度为10μM,25μM,50μM,100μM,150μM,200μM的CXC195作用于HepG2细胞和L-02细胞的平均生长存活率。用Western blotting检测150μM CXC195作用HepG2细胞后,PI3K-AKT-mTOR信号通路PI3K、AKT、mTOR及磷酸化蛋白和内质网应激相关蛋白表达变化。结果:(1)CXC195抑制HepG2细胞生长:台盼蓝拒染法和MMT比色法检测细胞存活结果显示,加入CXC195后,人肝癌细胞(HepG2)和正常肝细胞(L-02)的生长存活率均明显降低。并且,随着CXC195剂量从10μM逐渐增加到200μM,HepG2细胞存活率从97.3%逐渐降到42.9%,L-02细胞存活率从98.5%逐渐降到65.1%。不同剂量CXC195作用相同细胞生长存活率下降有显著差异(P<0.01),相同剂量CXC195作用于两组细胞比较,存活的肝癌细明显少于正常肝细胞L-02。MMT比色法检测结果表明,用150μMCXC195处理HepG2细胞12、24、48、72小时,细胞存活率也明显依次下降(P<0.01)。流式细胞术检测发现,150μM CXC195作用HepG2细胞24小时后,细胞存活于G0/G1期较多(71.62%vs45.17%,P<0.01),S期(17.53%vs41.11,P<0.01)和G2/M期(10.85%vs13.72%,P<0.05)细胞比例明显减少。结果表明:与正常肝细胞(L-02)相比,CXC195能更多抑制肝癌细胞(HepG2)生长,CXC195对肝癌细胞生长的抑制作用与药物浓度和药物作用时间呈正相关。并且CXC195主要作用于S期和G2/M期肝癌细胞HepG2。(2)CXC195诱导HepG2细胞凋亡:AnnexinV/PI双染色法标记后,通过流式细胞仪检测发现,各浓度CXC195诱导人肝癌细胞(HepG2)凋亡率明显高于正常肝细胞(L-02)(P<0.01)。随着CXC195剂量从10μM逐渐增加到150μM,HepG2细胞凋亡率从5.04%逐渐上升到35.21%,而L-02细胞凋亡率从4.03%逐渐上升到19.30%。随着CXC195剂量增加,HepG2细胞凋亡数量明显增多(P<0.01),相同剂量CXC195作用于两组细胞比较,HepG2细胞的凋亡率明显高于对照组L-02细胞。结果表明:CXC195诱导肝癌细胞(HepG2)凋亡作用显著强于正常肝细胞(L-02),且随着药物浓度增加,诱导凋亡作用逐渐增强。(3)CXC195对HepG2肝癌细胞PI3K-AKT-mTOR信号通路的影响:采用Western blotting分析,浓度为150μΜ的CXC195作用HepG2细胞,Bcl-2/Bax比值、p-PI3K和PI3K、p-AKT和AKT及p-mTOR和mTOR的表达量均非常明显少于未加CXC195对照组(P<0.01)。联合使用通路上PI3K、AKT、mTOR对应的抑制剂LY294002,SH-6和雷帕霉素处理5μmol/L后,细胞凋亡率超过50%,同时通路相关蛋白p-PI3K和PI3K、p-AKT和AKT及p-mTOR和mTOR的表达量较单用150uM CXC195均非常明显减少(P<0.01)。结果表明:CXC195通过抑制PI3K-AKT-mTOR信号传导通路相关蛋白诱导HepG2细胞凋亡,降低HepG2细胞增殖。(4)采用Western blotting检测发现,在经过浓度为150μΜCXC195作用后,HepG2细胞中GRP78,GRP94、CHOP、p-PERK,PERK,p-eIF2α,eIF2α、ATF4、IRE1α,p-ASK,ASK,p-p38,p38,p-JNK、JNK、Cleaved ATF6和ATF6表达量明显高于对照组。说明了内质网应激参与了CXC195诱导的HepG2细胞凋亡过程。结论:CXC195能显著抑制HepG2肝癌细胞增殖,诱导细胞凋亡,主要针对S期和G2/M期细胞。而对正常肝细胞(L-02)抑制生长和诱导凋亡的作用则明显较弱。CXC195的这一作用可能是通过抑制PI3K-AKT-mTOR信号通路蛋白表达和激活内质网应激来实现的。这些研究结果提示CXC195在体外对肝癌细胞有一定治疗效果。