利用免疫共沉淀技术初探二化螟GABA受体的亚基组成

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γ-氨基丁酸受体(GAB A receptor)是昆虫体内重要的抑制性神经递质作用靶标,GABA作用于该受体能使神经膜电位处于抑制状态。本文通过克隆二化螟GABA受体RDL、GRD和LCCH3亚基的第三、四跨膜之间胞内大环区的基因片段,然后借助大肠杆菌表达系统获得了纯化的融合蛋白并制备多克隆抗体,最终利用免疫共沉淀技术初探了二化螟GABA受体的亚基组成。1.二化螟GABA受体亚基胞内大环区片段的扩增利用软件TMHMM Server v.2.0分析二化螟GABA受体RDL、GRD和LCCH3氨基酸序列,寻找到差异性最大的胞内大环区基因序列:以二化螟的cDNA为模板扩增得到的GABA受体RDL1、RDL2、GRD和LCCH3基因胞内大环区片段长分别为348bp\363bp\381bp和387bp,预测各自编码蛋白的相对分子质量分别为 12.4kDa、13.1kDa、14.0kDa 和 14.0kDa。2.二化螟GABA受体亚基胞内大环区片段的原核表达及纯化利用大肠杆菌表达系统进行原核表达。将RDL1、RDL2、GRD和LCCH3胞内大环区基因片段连入pET-32a(+)载体并转入BL21(DE3)菌株中进行诱导表达,表达条件为:25℃,200rpm,1mM IPTG。结果表明,除了 32a-RDL2融合蛋白没有显著表达以外,其余融合蛋白均成功表达。其中,32a-RDL1和32a-LCCH3表达在上清液中,而32a-GRD表达在包涵体中。经过镍离子亲和层析法,最终得到纯化的、带有Trx和His标签的RDL1和GRD蛋白。由于融合蛋白自身表达的Trx-His标签较大,对制备多克隆抗体会产生影响,故使用肠激酶(Enterokinase,EK)特异性切除Trx-His标签得到目的蛋白。结果发现融合蛋白可能被EK非特异性酶切,导致无法对目的蛋白进行回收,影响后续实验。故重新选择仅含有6×His标签的pET-30a(+)质粒作为表达载体。结果表明:除30a-RDL2和30a-LCCH3没有显著表达外,其余蛋白均成功表达。30a-RDL1和30a-LCCH3主要表达在上清中,而30a-GRD主要表达在包涵体中;经过镍离子亲和层析法得到纯化的GRD蛋白;由于RDL1和RDL2胞内大环区同源性相似度高达62%,可能导致制备的抗体特异性低,因此选取同源性最低的一段氨基酸序列“DPHTLSKMGTIGR”和“PLPPPRTSTLNRPL”化学合成多肽制备多克隆抗体。3.二化螟GABA受体RDL和GRD亚基组成的检测利用RDL1、RDL2和GRD亚基的多克隆抗体与其相对应的抗原进行免疫印迹分析,结果表明RDL1、RDL2和GRD亚基各多克隆抗体之间不存在交叉互作。另外,使用RDL1、RDL2和GRD亚基的多克隆抗体分别与二化螟头部提取物进行免疫共沉淀反应,结果表明:RDL1和RDL2亚基可能存在同一个受体组合中,而RDL2和GRD亚基可能存在同一个受体组合中。
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