【摘 要】
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结核病（tuberculosis,TB）是一种慢性传染病。TB的病原体是以结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,M tb）为主的分枝杆菌。近年来由于抗生素的滥用导致耐药性的结核病频发,严重威胁公共卫生和国家社会安全。由于现有的抗结核药物和疗法已不能满足治疗耐药性结核病的需要,迫切需要新型治疗手段的出现。近些年,CRISPR-Cas系统以其在基因编辑领域具有巨大的应用潜
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结核病（tuberculosis,TB）是一种慢性传染病。TB的病原体是以结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,M tb）为主的分枝杆菌。近年来由于抗生素的滥用导致耐药性的结核病频发,严重威胁公共卫生和国家社会安全。由于现有的抗结核药物和疗法已不能满足治疗耐药性结核病的需要,迫切需要新型治疗手段的出现。近些年,CRISPR-Cas系统以其在基因编辑领域具有巨大的应用潜力成为研究的热门。M tb具有Ⅲ-A型CRISPR-Cas系统,其内源性的CRISPR-Cas系统对于研究M tb具有十分重大的研究价值。关于结核分枝杆菌噬菌体的研究和应用早在1938年就已经开始,结核分枝杆菌噬菌体以其特异性侵染能力被用于结核病的检测,以其高效的侵染被用于递送敲除元件。也有报道使用结核分枝杆菌噬菌体治疗结核病,并有一定的治疗效果。但至今还没有利用M.tbⅢ型CRISPR-Cas系统与分枝杆菌噬菌体结合起来用于防治结核病的报道。本研究旨在利用结核分枝杆菌的Ⅲ-A型CRISPR-Cas系统,设计带有靶向结核分枝杆菌基因组spacer的mini-CRISPR,利用噬菌体作为载体递送mini-CRISPR,激活Ⅲ-A型CRISPR-Cas系统的干涉机制,从而实现对M tb的杀伤。同时我们也针对M.tb CRISPR-Cas系统的获取功能进行了初步研究。本研究通过构建带有mini-CRISPR的pMV261质粒和phAE159噬菌体,分别通过电转化和侵染检测mini-CRISPR的干涉效率。结果发现,mini-CRISPR不影响结核分枝杆菌的转化效率,但mini-CRISPR可以显著降低靶基因的mRNA水平,这说明结核分枝杆菌CRISPR-Cas系统具有一定的干涉功能,可以切割RNA,但其DNA切割能力受限。除此之外我们通过在牛结核分枝杆菌（Mycobacterium bovis,M bovis）中超表达Cas1Cas2蛋白,以研究CRISPR-Cas系统的获取功能。但PCR检测和高通量检测都未发现有新spacer的获取。值得一提的是,在构建噬菌体载体的过程中,我们发现一种新型的载体构建技术TEDA法可用于噬菌体载体的构建,相比与传统的体外包装的方法,该方法具有操作步骤简单、快速、高效的特点,且构建成本非常低。在本研究中,我们也尝试对结核分枝杆菌的噬菌体进行了一部分研究。在研究噬菌体D29的gp69基因时,发现卡那霉素抑制了噬菌体D29的侵染效率。进一步研究发现氨基糖苷类抗生素中卡那霉素、潮霉素和链霉素均能抑制噬菌体D29和phAE159的侵染效率,且抑制能力随抗生素浓度的提高而增强。这种抑制现象在耻垢分枝杆菌、结核分枝杆菌和牛结核分枝杆菌中都存在。通过对比大肠杆菌噬菌体表明氨基糖苷类抗生素抑制分枝杆菌噬菌体的侵染是特异性的。通过绝对定量PCR技术检测噬菌体DNA,我们将这种抑制现象定位在噬菌体DNA注射进宿主至DNA复制这一阶段。但由于技术手段的缺失,我们目前尚未准确定位到准确的作用位置,以及无法阐述其抑制现象的分子机制。这一结果提示我们,在研究结核分枝杆菌的噬菌体治疗结核病时需要考虑抗生素对噬菌体的影响。同样在利用噬菌体快速检测耐药性结核分枝杆菌感染时也应注意抗生素对噬菌体的影响。同时这个结果也提示我们,抗生素并不仅仅作用于细菌,它们同样可以作用于噬菌体。
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