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哈维氏弧菌是海洋中常见的一种致病性弧菌,能够感染海洋鱼虾类以及人类。哈维氏弧菌感染人的主要途径包括食用生的或未煮熟的水产养殖鱼虾类,或者伤口直接接触海水。被感染后会出现一系列严重的炎症反应,严重危害人类健康。目前,针对哈维氏弧菌感染的主要治疗方法是传统的抗生素疗法。然而,越来越多的证据表明抗生素的滥用会引起耐药菌株的产生,不利于后续治疗。先天免疫是宿主抵抗病原体入侵的第一道防线。病原体入侵宿主后会激活免疫细胞上的模式识别受体,进而激活下游的炎症相关信号通路诱导炎性细胞因子的分泌,招募更多的免疫细胞到达病灶清除病原体。然而,有关哈维氏弧菌引起机体炎症反应的分子机制尚不清楚。本研究成功构建哈维氏弧菌感染小鼠腹腔巨噬细胞模型,确定哈维氏弧菌激活模式识别受体TLR2和NLRP3转录水平最显著。利用TLR2缺失鼠和抑制剂阻断实验研究TLR2、MAPK、NF-κB和AKT信号通路在哈维氏弧菌引起的炎症反应中的作用。通过检测IL-1β的产生、Caspase1的活化、NLRP3、ASC蛋白的表达和使用NLRP3炎性小体相关通路抑制剂研究NLRP3炎性小体在哈维氏弧菌感染中的作用。通过研究哈维氏弧菌引起宿主细胞炎症反应的分子机制,以期为防治哈维氏弧菌感染引起的疾病提供全新的治疗靶标。本研究的结果如下:哈维氏弧菌感染小鼠腹腔巨噬细胞模型的建立。使用q PCR检测炎性细胞因子相关基因转录水平,发现哈维氏弧菌可以上调炎性细胞因子Il-6、Il-10、Il-18、Il-1β、Tnf-α和Ifn-γ的基因转录水平,并且Il-1β上调极显著。使用ELISA检测炎性细胞因子的分泌水平,发现哈维氏弧菌促进炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-12和TNF-α的分泌,表明已成功建立哈维氏弧菌感染小鼠腹腔巨噬细胞诱导炎症反应模型,为后续研究哈维氏弧菌感染的分子机制奠定基础。哈维氏弧菌激活p38 MAPK、NF-κB和AKT信号通路的研究。通过利用哈维氏弧菌感染TLR2缺失鼠和野生型小鼠腹腔巨噬细胞模型以及MAPK、AKT和NF-κB信号通路相关抑制剂研究TLR2、p38 MAPK、NF-κB和AKT信号通路在哈维氏弧菌感染中的作用。使用q PCR、Western Blotting、ELISA和免疫荧光等技术,分别检测Tlrs和炎性细胞因子Il-1β、Il-6、Il-12和Tnf-α相关基因的转录水平,检测磷酸化蛋白p38、ERK、JNK、AKT、p65、IKKα/β和总蛋白p38、ERK、JNK、AKT、IκBα、IKKβ的表达水平,检测炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-12和TNF-α的分泌水平,以及分析NF-κB p65蛋白在哈维氏弧菌感染的小鼠腹腔巨噬细胞中的定位。结果表明哈维氏弧菌上调了Tlr1、Tlr2、Tlr3、Tlr5、Tlr6、Tlr7、Tlr8、Tlr9、Tlr11、Tlr12和Tlr13基因的转录水平,并且Tlr2的转录水平上调极显著。同时哈维氏弧菌可以激活磷酸化蛋白p38、ERK、JNK、AKT、p65、IKKα/β的表达,促进炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-12和TNF-α的分泌以及诱导NF-κB p65蛋白向细胞核易位,并且在哈维氏弧菌感染的TLR2缺失鼠腹腔巨噬细胞中这些反应被明显抑制。同时发现使用MAPK、AKT和NF-κB信号通路相关抑制剂可以阻断炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-12和TNF-α的分泌。综上所述,哈维氏弧菌以部分依赖于TLR2的方式激活p38 MAPK、NF-κB和AKT信号通路调控小鼠腹腔巨噬细胞促炎细胞因子的产生,其中AKT信号通路具有负调控的作用。p38 MAPK和NF-κB信号通路的激活可以作为炎性小体激活的第一信号,为进一步研究哈维氏弧菌激活NLRP3炎性小体信号通路奠定基础。哈维氏弧菌激活NLRP3炎性小体的研究。由于哈维氏弧菌通过激活p38 MAPK和NF-κB信号通路上调Il-1β的转录水平促进IL-1β的生成,但IL-1β的分泌还可能与炎性小体的激活有关。本研究利用哈维氏弧菌感染小鼠腹腔巨噬细胞模型以及泛Caspase抑制剂和NLRP3炎性小体信号通路相关抑制剂研究NLRP3炎性小体在哈维氏弧菌感染中的作用。使用Western Blotting、q PCR、ELISA和免疫荧光等技术,分别检测NLRP3、ASC、GSDMD、pro-Caspase1、pro-IL-1β、Caspase1 p20和IL-1βp17的表达水平,检测Nlrs、Caspase1和Il-1β的转录水平,检测炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-12和TNF-α的分泌水平,以及分析NLRP3和ASC蛋白在小鼠腹腔巨噬细胞中的定位。结果表明哈维氏弧菌可以促进NLRP3、pro-Caspase1、pro-IL-1β、Caspase1 p20和IL-1βp17的表达,同时哈维氏弧菌可以诱导ASC寡聚化和GSDMD-NT的生成。哈维氏弧菌上调了Nlrs中Nod1、Nod2、Nlrp1、Nlrp2、Nlrp3、Nlrp6、Nlrc4、Nlrc5以及Caspase1和Il-1β的转录水平,且Nlrs中Nlrp3转录水平上调极显著。哈维氏弧菌促进炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-12和TNF-α的分泌。哈维氏弧菌感染使NLRP3呈点状聚集在细胞核周围,ASC呈斑点样聚集在细胞核和细胞质中。泛Caspase抑制剂和NLRP3炎性小体信号通路相关抑制剂可以阻断IL-1βp17的生成和炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-12和TNF-α的分泌。综上所述,哈维氏弧菌通过激活NLRP3炎性小体,活化Caspase1,诱导IL-1β的分泌参与小鼠腹腔巨噬细胞炎症反应,并且呈现时间依赖的特点。综上所述,本研究首次建立哈维氏弧菌感染小鼠腹腔巨噬细胞模型,发现哈维氏弧菌可以通过部分依赖于TLR2的方式激活p38 MAPK和NF-κB信号通路诱导炎症反应,并提供NLRP3炎性小体活化的第一信号。同时,哈维氏弧菌也可以激活NLRP3炎性小体的第二信号,活化Caspase1,促进IL-1β的分泌,进而诱导炎症反应。本研究阐明了哈维氏弧菌诱导小鼠腹腔巨噬细胞炎症反应的分子机制为预防和治疗哈维氏弧菌感染提供参考。该论文有图35幅,表14个,参考文献170篇。