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第一部分改良三袖套法建立大鼠左肺原位移植动物模型目的采用改良袖套法技术建立大鼠同种异体左肺移植模型。方法对供肺获取、套管制作、自体肺切除、血管和气管袖套套接技术进行改进。30例清洁级SD大鼠左供肺获取后置于40C的LPDG液保存3小时,随后行肉眼直视下同种异体左肺移植术,再灌注4h后阻断右肺门,分别测定阻断前后气道压力、动脉血气变化、肺湿/干重比率及光镜下肺组织结构变化。评价该模型复制移植物缺血再灌注损伤的能力。结果同种异体左肺移植模型在肉眼直视下单人完成,供受体动静脉和支气管套管吻合时间分别为:肺动脉(5±1)min、肺静脉(9±4)min、支气管(2±0.5)min。总手术时间(59±10)min。手术成功率90%(27/30),术后生存率100%。实验结果显示该模型成功复制出同种异体肺移植缺血再灌注损伤的变化。结论本模型符合大鼠肺移植模型建立的优点,全部操作在肉眼直视下单人完成;供肺的获取较为快速,使用的套管更简单,套管技术趋于简化,肺移植时血管套接技术成功率高,整体手术时间操作缩短。该模型复制出移植肺缺血再灌注损伤的变化,是适合肺移植缺血再灌注损伤研究的理想模型。第二部分骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定、标记及其对大鼠移植肺缺血再灌注损伤的保护作用目的分离、培养、鉴定和标记骨髓间充质干细胞(BMSCs),观察BMSCs对大鼠左肺移植物缺血再灌注损伤的保护作用并探讨其作用机制。方法以SD大鼠为供受体,采用改良袖套法技术建立同种异体左肺移植模型。设立假手术组(A组)、I/R组(B组)和BMSCs组(C组),每组n=7,离体供肺静脉40C的LPDG液逆行灌注,灌注后行左肺原位移植,移植肺再灌注4h后,阻断右肺门,测量气道压力,动脉血PaO2、PaCO2。随后处死大鼠,分别测定:肺W/D比率、肺组织中SOD活性、MDA含量、MPO活性;光镜观察移植物病理组织学变化;RT-PCR和Western-blot了解旁分泌因子VEGF的表达;ELISA检测受鼠血浆中TNF-a和IL-10的变化;免疫组化检测TNF-a和bcl-2表达情况;TUNEL法检测移植肺细胞凋亡水平。结果与假手术组相比,I/R组气道压力升高、PaO2下降、肺W/D比率上升,SOD活性降低,MDA含量和MPO活性升高(P<0.01),表明I/R组相对于假手术组确实造成了明显的缺血再灌注损伤;与I/R组相比,BMSCs组气道压力降低、PaO2上升、肺W/D比率下降,SOD活性增高,MDA含量和MPO活性下降(P<0.01);与I/R组相比,BMSCs组:血浆TNF-a水平降低,IL-10水平升高;病理检查肺泡间质水肿明显减轻,炎症细胞浸润减少,肺泡腔内水肿液和红细胞少见;免疫组化TNF-a表达减弱、bcl-2表达增强(P<0.01);TUNEL法检测移植肺细胞凋亡减少(P<0.01)。基因和蛋白水平检测显示BMSCs组肺组织旁分泌因子VEGF较假手术组、I/R组明显升高(P<0.01)。结论(1)氧化损伤等指标检测表明I/R组确实复制了移植肺的IRI;BMSCs移植能减轻移植肺的缺血-再灌注损伤。(2)BMSCs通过其抗氧化、抗炎、抗凋亡和旁分泌效应等抗损伤、促组织修复等多种途径明显减轻移植肺缺血再灌注损伤,提高肺移植术后早期肺功能。因此BMSCs移植可成为预防和减轻肺移植术后缺血再灌注损伤的一种有益尝试。第三部分缺血后适应基础上骨髓间充质干细胞移植对大鼠移植肺缺血再灌注损伤的保护作用目的观察缺血后适应(I-postC)基础上BMSCs移植对大鼠同种异体左肺移植物缺血再灌注损伤的保护作用并探讨其作用机制。方法以SD大鼠为供受体,采用改良三袖套法技术建立同种异体左肺移植模型。设立I/R组(A组), I-postC组(B组),BMSCs组(C组)和I-postC + BMSCs组(D组),每组n=14,离体供肺静脉40C的LPDG液逆行灌注,灌注后行左肺原位移植,移植肺再灌注4h和72h后,分别随机抽取大鼠7只阻断右肺门,测量气道压力,动脉血PaO2、PaCO2。随后处死大鼠测定:肺W/D比率、肺组织中SOD活性、MDA含量、MPO活性;光镜观察移植物病理组织学变化;RT-PCR和Western-blot了解旁分泌因子VEGF的表达;ELISA检测受鼠血浆中TNF-a、IL-10、G-CSF和GM-CSF的变化;免疫组化检测TNF-a和bcl-2表达情况;TUNEL法检测移植肺细胞凋亡水平。免疫荧光法检测肺组织中BMSCs的定位情况。结果基因和蛋白水平检测显示单纯BMSCs组、I-postC+BMSCs组肺组织旁分泌因子VEGF表达较I/R组、I-postC组明显升高(P<0.01); G-CSF,GM-CSF(72h)明显升高(P<0.01)。与I/R组比较,I-postC组、BMSCs组、I-postC+BMSCs组:TNF-a明显降低,IL-10明显升高(P<0.01);气道压力降低、PaO2上升、肺W/D下降、SOD活性增高、MDA含量和MPO活性下降(P<0.01);bcl-2表达增强,TUNEL法检测移植肺细胞凋亡减少(P<0.01)。与I/R组、I-postC组、BMSCs组相比,光镜检查I-postC+BMSCs组肺泡间质水肿减轻最显著,炎性细胞浸润、肺泡腔内水肿和渗出改变减轻最明显。免疫荧光法检测72h取的肺组织,BMSCs在肺组织中定位,主要分布在肺细支气管壁周围。结论在I-postC的基础上,再行BMSCs移植,减轻移植肺缺血再灌注损伤的程度最显著。I-postC基础上BMSCs移植减轻移植肺IRI、提高肺移植术后早期肺功能的机制与其抗氧化、抗炎、抗凋亡、旁分泌效应和干细胞归巢等密切相关,并可能与I-postC先减轻移植肺IRI,改善BMSCs存活的微环境,提高BMSCs迁移进入肺组织的“质”和“量”有关。因此I-postC基础上BMSCs移植可成为预防和减轻同种异体肺移植物IRI的一种全新的策略。