苯丙烷类化合物(如花青素、单宁、黄酮醇和木质素等)是杨树体内一类重要的次生代谢产物,其不仅广泛参与杨树抗虫、抗病、抵御紫外辐射和抗衰老等生理过程,还是杨树木材的重要组分之一。因此,解析杨树类黄酮和木质素的生物合成机制具有重大的科学意义和产业前景。本论文从杨树中筛选到了一个可同时影响类黄酮和木质素生物合成的R2R3-MYB转录因子MYB93,利用细胞生物学、分子遗传学和生物化学等实验手段,解析了MYB93对类黄酮和木质素合成的转录调控机制。本论文主要研究结果如下:(1)MYB93是一个在叶片、茎干中高水平表达,定位于细胞核的转录抑制子qRT-PCR分析显示,在野生型毛白杨中,MYB93在叶片茎干中大量表达。将MYB93启动子连接GUS报告基因的载体转入毛白杨,GUS染色分析显示其在老叶和茎中染色程度最深,与qRT-PCR结果一致。亚细胞定位证明了MYB93定位于细胞核中;酵母自激活实验证明MYB93具有转录抑制功能。(2)PtoMYB93抑制了花青素、单宁以及木质素的生物合成为阐明MYB93转录因子的生物学功能,构建其超量表达和CRISPR/Cas9基因敲除的表达载体,转化至野生型毛白杨。表型观察和组织化学染色分析显示,在超量表达MYB93的转基因杨树叶片中,花青素和单宁的含量显著降低;而在敲除MYB93的杨树中,花青素和单宁的含量均有所提高。同时,与野生型毛白杨相比,MYB93超量表达转基因的植株高度变矮,茎秆直径变细,茎部木质部细胞层数变少,木质素自发荧光变弱,木质素含量降低;敲除株系虽然呈现相反趋势,但无显著差异。qRT-PCR分析显示,在MYB93超量表达的转基因杨树中,花青素、单宁及木质素合成途径中关键酶的表达水平明显下调,在MYB93敲除的毛白杨中,它们的表达水平均上调,说明MYB93对花青素、单宁以及木质素生物合成的影响可能是通过调节关键酶基因的表达来完成。(3)MYB93通过调控下游酶基因的启动子,利用EAR结构域抑制关键酶基因的表达通过Effector-Reporter实验,将MYB93超量表达载体与关键酶基因的启动子载体共同转化烟草,证明MYB93可调控花青素、单宁以及木质素合成的关键酶基因的启动子,抑制其表达,从而抑制花青素、单宁及木质素的生物合成。前人研究表明,在MYB转录抑制子中存在EAR结构域,其在花青素和单宁合成中发挥重要作用。将突变掉EAR(LxLxL)结构域的突变体△MYB93,与关键酶基因启动子进行瞬时表达分析显示,突变掉EAR结构域后,△MYB93对下游酶基因启动子的抑制调控功能缺失。暗示MYB93对花青素、单宁及木质素合成的抑制作用可能是通过EAR结构域完成的。(4)MYB93与TT8、TTG1形成MBW复合体,可以增强MYB93对花青素和单宁生物合成的抑制功能研究表明,在类黄酮生物合成中,MYB转录因子、bHLH转录因子和WD40蛋白可以形成MBW复合体,增强MYB转录因子对下游基因的激活或抑制功能。在烟草叶片中瞬时表达分析显示,当加入TT8、TTG1时,MYB93对类黄酮途径中关键酶基因的抑制作用增强。酵母双杂交的实验证明MYB93与TT8存在直接相互作用,TT8作为桥梁使其与MYB93、TTG1形成MBW复合体来负调控类黄酮途径的生物合成。(5)MYB93和MYB57转录调控功能差异的分子机制分析MYB93和MYB57均为拟南芥AtMYB4的同源基因,但MYB93可同时抑制花青素、单宁及木质素的生物合成,而MYB57仅能抑制花青素和单宁的合成,二者在调控功能上存在明显差异。组织表达特异性分析显示,MYB93在叶片、木质部和韧皮部等组织均具有较高的表达水平,而MYB57仅在叶片具有较高表达水平,在木质部和韧皮部表达水平极低,暗示其不参与木质素的合成调控。qRT-PCR和瞬时表达分析显示,MYB57不能结合到木质素合成关键酶基因的启动子上,调控其表达。综上所述,本研究初步证明,MYB93作为转录抑制因子,其通过与TT8、TTG1形成MBW复合体,抑制类黄酮合成途径关键酶基因的表达活性,从而负调控花青素和单宁的生物合成。同时,MYB93也可通过下调木质素合成途径关键酶基因的表达,抑制木质素的生物合成。本论文研究结果为解析杨树中苯丙烷代谢的分子遗传机制提供了新的证据,也为林木育种和木材优化奠定了基础。