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野生稻是水稻育种和生物技术利用的宝贵资源,其中药用野生稻(O.oJ~cinalis)具有抗病性(白叶枯病,稻瘟病,病毒病)、抗虫性(褐飞虱,白背飞虱,稻纵卷叶螟,稻瘿蚊,稻蓟马)、耐不良环境因子(耐盐,苗期耐冷,耐寒越冬),高蛋白质含量等优良性状,已被广泛用于水稻育种中。因此,加强鉴定评价以充分利用药用野生稻的优良基因尤其重要。
可转化人工染色体(TAC)具有克隆大片段DNA和直接用于转化植物的功能,是构建植物基因组文库的理想载体。本实验室在原有TAC载体的基础上开发新版本的TAC载体pYLTAC747NH/SacB,它采用pVSl复制子替代原TAC载体的Ri复制子行使在农杆菌的复制功能。但它的运载能力,转化效率,以及在农杆菌稳定性还没有得到鉴定。本研究的目的是用该新载体构建一个药用野生稻基因组文库,检验该载体的各种性能。本研究主要取得了以下结果:
(1)从药用野生稻成株叶片制备出高质量的超大片段核DNA,优化了部分酶切的条件,构建了一个有20631克隆的基因组文库,以单克隆保存在54块384孔板中。插入子分布范围在15~50kb,平均插入子大小为30kb。
(2)随机挑选了30个TAC克隆进行在大肠杆菌和农杆菌中结构稳定性的检测,结果表明所有挑选的克隆在大肠杆菌和农杆菌中都能保持结构稳定。证明该新TAC载体在农杆菌有较好的稳定性。
(3)挑选了2个插入子大小分别为38kb和45kb的TAC克隆进行水稻的遗传转化,分别获得28和24个转化体。通过对转化体的PCR和Southern杂交检测,证明这2个克隆所携带的外源片段成功地整合到水稻的基因组中,并得到稳定的遗传。此文库的建立为药用野生稻的优良基因的筛选奠定了基础。