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[背景]癫痫是脑卒中后常见的并发症。流行病学调查发现脑卒中后癫痫的发病率超过10%,占新确诊的成年癫痫患者的三分之一；60岁以上新诊断的癫痫患者中,近一半与脑血管病有关。随着生活质量和医疗水平的提高,脑卒中患者存活期延长,脑卒中后癫痫的患病率也随之增加。然而,目前仍然缺乏脑卒中后癫痫有效防治办法,对其发生机制也不甚了解。成年哺乳动物体内神经祖细胞主要位于海马齿状回颗粒下层和侧脑室的室下区,它们能够增殖分化成为神经元。在新生神经元的发育过程中,它们逐渐伸出轴突和树突,与周围的细胞形成功能性突触联系并整合到原有的神经环路中,发挥相应的作用。神经发生过程受多种因素影响。有研究表明脑卒中的新生大鼠成年后认知功能障碍、呈现高度兴奋状态并伴有癫痫发生。还有报道指出,脑卒中促进海马神经祖细胞活化增殖,新生细胞向损伤部位迁移,参与神经功能修复；脑卒中或癫痫后,海马新生神经元形态和分布异常。卒中后新生神经元的异常是否与癫痫的发生发展有关,至今仍是一个谜。[目的]观察缺血性脑卒中小鼠齿状回新生神经元的形态和功能以及与癫痫发生的关系。[方法]通过大脑中动脉栓塞(MCAO)构建4月龄小鼠脑缺血模型或相应的假手术对照,本实验分别采用了雄性C57BL/6J小鼠、Nestin-Cre小鼠、ChR2小鼠、TeTX小鼠为研究对象。通过磁共振(MRI)和Fluoro-Jade C染色检测小鼠卒中后脑部受损情况；采用逆转录病毒(RV-EGFP)、腺相关病毒(AAV-EGFP)和狂犬病毒(△Rabies-mCherry)感染以及荧光染料显微注射标记新生神经元；使用BrdU染色标记新生细胞；利用RT-PCR方法检测中间神经元、胶质细胞和颗粒细胞的GAD67、GFAP和Calbindin-D28K的mRNA表达水平；通过全细胞膜片钳电生理技术记录新生颗粒神经元与原有颗粒神经元的电生理特征；通过红藻酸氨(KA)诱发急性癫痫发作；通过视频脑电图监测小鼠的癫痫发作情况。[结果]MCAO小鼠反复自发癫痫发作。4月龄雄性C57BL/6小鼠行MCAO (C57-MCAO小鼠)或假手术(C57-sham小鼠)处理,术后连续3个月记录脑电图和癫痫相关行为,结果显示C57-MCAO小鼠术后1月左右开始出现反复自发癫痫发作现象并伴有脑电图异常。MCAO小鼠海马新生神经元形态异常。4月龄雄性C57BL/6小鼠行MCAO (C57-MCAO小鼠)或假手术(C57-sham小鼠)处理,海马齿状回注射逆转录病毒(RV-EGFP)标记新生神经元。2周及4周后,观察新生神经元数量和形态,结果显示C57-MCAO小鼠术后GFP+细胞数量显著增加,双极细胞所占比例增加,并出现多个基树突。MCAO小鼠海马新生神经元突触连接异常。方法一：4月龄雄性C57BL/6小鼠行MCAO (C57-MCAO小鼠)或假手术(C57-sham小鼠)处理,海马齿状回注射逆转录病毒(RV-EGFP)标记新生神经元,术后4周取动物脑片,分别对GFP+细胞和GFP-细胞显微注射绿色和红色生物素染料,发现C57-MCAO小鼠GFP+细胞轴突纤维深入到分子层。方法二：4月龄雄性C57BL/6小鼠行MCAO (C57-MCAO小鼠)或假手术(C57-sham小鼠)处理,腹腔注射BrdU标记新生细胞,海马齿状回注射AAV-EGFP标记所有神经元,3周后同样的部位注射△Rabies-mCherry标记已被AAV感染的神经元及其上级神经元,此后1周取脑片观察齿状回EGFP+/mCherry+、EGFP+/mCherry"和EGFP-/mCherry+细胞的数量、形态和分布,与BrdU是否共定位,结果显示大部分EGFP-/mCherry+细胞是BrdU+细胞。MCAO小鼠海马新生神经元异常融入齿状回神经环路。方法一：4月龄雄性Nes-Cre小鼠行MCAO手术(Nes-Cre-MCAO小鼠)或假手术(Nes-Cre-sham小鼠),术后1周海马齿状回注射腺相关病毒(AAV-ChR2-EGFP),同时连续5天腹腔注射BrdU;术后4周,进行NeuN和BrdU染色,观察两组动物海马GFP+/NeuN+细胞和GFP+/NeuN+/BrdU+细胞的数量、形态、分布以及NeuN+/BrdU+细胞占总GFP+细胞的比例,结果显示Nes-Cre-MCAO小鼠较Nes-Cre-sham小鼠新生神经元数量增加,两组动物NeuN+/BrdU+细胞数量没有明显变化。方法二：4月龄雄性ChR2小鼠行MCAO手术(ChR2-MCAO小鼠)或假手术(ChR2-sham小鼠),并给予他莫昔芬(TAM)诱导表达ChR2和EGFP,术后4周取脑片记录DG区ChR2+/EGFP+细胞与CA3区以及DG区的ChR2-/EGFP细胞之间的突触联系,结果显示ChR2-MCAO小鼠与ChR2-sham小鼠CA3区ChR2-/EGFP-细胞均可以记录到EPSCs, ChR2-MCAO组小鼠DG区ChR2-/EGFP细胞可以记录到EPSCs,而在ChR2-sham组小鼠则记录不到DG区ChR2-/EGFP细胞的EPSCs。MCAO小鼠海马新生神经元与原有成熟颗粒细胞形成功能性突触连接。ChR2小鼠持续给予TAM,行MCAO(ChR2+-MCAO小鼠)或假手术(ChR2+-sham小鼠),术后4周,取脑片记录DG区ChR2+/EGFP+细胞与CA3区以及DG区的ChR2-/EGFP细胞之间的突触联系。结果显示ChR2+-MCAO组小鼠和ChR2+-sham小鼠CA3区ChR2-/EGFP-细胞以及ChR2-MCAO组小鼠DG区ChR2-/EGFP细胞可以记录到EPSCs;该EPSCs与蓝光光强呈线性正相关,对AMPA受体拮抗剂敏感。小鼠海马新生神经元中特异性表达TeTX可特异性阻断其异常突触传递,并不影响MCAO小鼠新生神经元存活和电生理特征。4月龄雄性TeTX小鼠行MCAO处理(TeTX-MCAO小鼠),一组动物给予TAM诱导新生神经元中表达TeTX (TeTX+-MCAO小鼠),另外一组动物给予正常对照溶剂(TeTX-MCAO小鼠),4周后,使用Fluoro-Jade C染色了解TeTX对细胞存活的影响,结果表明两组动物F-J+细胞数量没有明显差异；进一步使用电生理记录两组动物GFP+和GFP-细胞的EPSCs和IPSCs,结果显示两组动物的GFP+和GFP细胞的EPSCs之间以及GFP+和GFP-细胞的IPSCs之间没有明显差异。TeTX小鼠行MCAO (TeTX--MCAO小鼠),术后1周海马齿状回注射腺相关病毒(AAV-ChR2),4周后,两组动物分别给予多西环素(DOX)(TeTX+-ChR2+-MCAO-mice)和正常对照溶剂(vehicle)(TeTX--ChR2+-MCAO-mice)1周,然后第一次记录光刺激新生神经元和电刺激苔藓纤维时CA3区和DG区的EPSCsNMDA,然后两组全部更换为正常饮水1周,进行第二次记录(同第一次记录)。结果显示,TeTX--ChR2+-MCAO小鼠可以在CA3区和DG区记录到光刺激和电刺激后的EPSCsNMDA,TeTX+-ChR2+-MCAO小鼠只能在CA3区记录到电刺激后的EPSCsNMDA。特异性阻断海马新生神经元突触传递能降低MCAO小鼠癫痫发作的频率和强度。4月龄雄性TeTX小鼠行MCAO (TeTX-MCAO小鼠)或假手术(TeTX-sham小鼠)处理,3周后开始持续给予多西环素(TeTX+-MCAO/sham小鼠)或对照溶剂(TeTX"-MCAO/sham小鼠),1周后,开始连续观察脑电图和行为学变化。结果显示TeTX-sham小鼠无癫痫发生；TeTX--MCAO小鼠癫痫有发作,并且随着脑缺血恢复时间的延长其发作次数增加；TeTX+-MCAO小鼠癫痫发作次数和单次发作持续时间较TeTX--MCAO小鼠低。我们也将4月龄雄性TeTX小鼠持续给予多西环素(TeTX+小鼠)或对照溶剂(TeTX小鼠),再行MCAO (TeTX+/--MCAO小鼠)或假手术(TeTX+/--sham小鼠)处理,给予10-30mg/kg的红藻氨酸(KA)腹腔注射诱发急性癫痫发作,观察注射KA后各组动物脑电图、癫痫发作情况以及死亡率。结果发现随着KA剂量的增加,各组动物死亡率增加,以TeTX--MCAO小鼠居多；TeTX+/--sham小鼠和TeTX+-MCAO小鼠脑电图基本正常；TeTX--MCAO小鼠脑电图波形出现明显异常,癫痫指数高于其他组小鼠。进一步使用TeTX小鼠行MCAO (TeTX-MCAO小鼠)或假手术(TeTX-sham小鼠),术后4周开始持续记录两组动物(TeTX--MCAO/sham小鼠)癫痫发作情况4周(第一次记录,R1),然后两组动物持续5周给予多西环素,记录后四周两组动物(TeTX+-MCAO/sham小鼠)癫痫发作情况(第二次记录,R2),然后两组动物持续5周给予正常饮水,记录后四周两组动物(TeTX--MCAO/sham小鼠)癫痫发作情况(第三次记录,R3)。结果发现,整个实验期间,TeTX+/--sham小鼠几乎没有癫痫发作；对于TeTX-MCAO小鼠,R1时,其癫痫发作强度频率均明显高于假手术组小鼠,R2时,癫痫发作强度频率较R1有明显下降,R3时,癫痫发作强度频率恢复到R1时的水平。[结论]新生神经元异常整合到原有的神经环路是卒中后癫痫反复发作的细胞基础,阻断该异常突触连接可以降低MCAO小鼠癫痫发生频率和强度。该研究结果为卒中后癫痫的干预和治疗提供了新的思路。