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蛞蝓又名鼻涕虫,为有肺的软体动物,属腹足类腹足纲蛞蝓科,是一类常见的农作物害虫。蛞蝓作为一种传统中药,具有清热祛风,消肿解毒,破瘀通经等功效,民间常用于肺癌等恶性肿瘤的治疗。近年来,国内外学者对蛞蝓提取物的抗肿瘤作用进行了深入研究,发现其体外抗肿瘤效果较为显著,且主要活性成分可能是多糖类物质。但对其活性成分的分离纯化、结构及构效关系的研究却未见报道。为了寻找高活性的蛞蝓多糖并进行构效关系研究,我们以双线嗜粘液蛞蝓[Philomycus bilineatus(Benson)]为原料,对其多糖进行了系统的提取、分离纯化、结构解析、化学修饰及体外抗肿瘤、抗氧化、免疫调节等活性进行研究,并从中分离纯化出一种新的高活性糖蛋白(PBPa11),为进一步开发蛞蝓多糖药物提供理论依据和技术支持。本论文共有五个部分,分别从蛞蝓多糖的提取纯化、理化性质、结构分析、结构修饰和体外活性等方面进行了研究。主要结果如下:1双线嗜粘液蛞蝓多糖闪式提取工艺研究采用单因素实验结合响应面BBD试验设计分析,对蛞蝓原料的酶解和多糖提取工艺进行优化。实验结果表明,蛞蝓原料的蛋白酶水解最佳条件为:胰蛋白酶、pH8.0、温度45℃、加酶量1.8%,料液比1:1,反应4 h。在此基础上,进行多糖的闪式提取工艺研究,最佳提取条件为:温度63 ℃、转速5档(22000 rpm)、料液比1:1.6、提取时间33 min。在此优化条件下,蛞蝓粗多糖的实际得率约为5.19%。体外抗肿瘤实验结果表明,双线嗜粘液蛞蝓主要活性多糖存在于体壁组织中。2双线嗜粘液蛞蝓多糖的分离纯化及理化性质研究在体外抑制A549细胞增殖活性实验结果的指导下,双线嗜粘液蛞蝓粗多糖经 DEAE Sepharose FastFlow、Sepharose 4 FastFlow、Sepharose 6 FastFlow等层析填料的分离纯化,共得到4个组分:PBPn11、PBPa11、PBPa21 和 PBPa12。(1)PBPn11总得率为3.82%,含多糖58.82%,糖醛酸7.48%,氨基己糖38.56%,不含蛋白质,HPLC测定为单一多糖,分子量约为3.330×106Da。(2)PBPa11总得率为1.73%,含多糖48.45%,蛋白质22.34%,糖醛酸4.42%,氨基己糖20.32%,HPLC测定为单一糖蛋白,分子量约为 2.388×106Da。(3)PBPa21总得率为2.15%,含多糖51.65%,蛋白质27.99%,氨基己糖18.56%,不含糖醛酸,HPLC测定为单一糖蛋白,分子量约为 2.570×106Da。(4)PBPa12总得率为0.31%,含多糖50.13%,糖醛酸30.12%,氨基己糖40.40%,不含蛋白质,推测可能是一种糖胺聚糖混合物,HPLC测得主成分的分子量约为4.1×104Da。3双线嗜粘液蛞蝓多糖单一组分的结构研究通过糖组成分析、甲基化分析、PMP柱前衍生化分析、FT-IR和NMR(1D:1H NMR 谱,13CNMR谱,DEPT135°谱;2D:COSY谱,TOCSY谱,HMQC谱,HMBC谱和NOESY谱)等方法,研究了双线嗜粘液蛞蝓多糖单一组分的化学结构。(1)PBPn11主要由摩尔比为1.00:0.27:0.16的T3糖、N-乙酰氨基葡萄糖与和半乳糖组成。甲基化结果表明半乳糖为末端连接、N-乙酰氨基葡萄糖为1,4连接。NMR分析结果表明含有→4)-α-GlcpNAc-(1→残基。(2)HPLC-TOF/MS和NMR分析结果表明,T3单糖是唾液酸类似物,分子量为355.3 Da,推测其为:(2S,4R,5R,6R)-5-(2,3-dihydroxypropanamido)-2,4-dihydroxy-6-(1,2,3-trihydroxypropyl)tetrahydro-2H-pyran-2-carboxylic acid。(3)PBPa11主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖、山梨糖、N-乙酰氨基葡萄糖、T3单糖及少量的3(4)-O-甲基己糖组成。甲基化结果表明,含有末端连接半乳糖、1,4连接的N-乙酰氨基葡萄糖与2,6连接的山梨糖。β-消除反应和肼解实验证明,PBPa11中同时存在O-型和N-型糖肽键。体外活性实验证明O-型连接的糖肽与其抗肿瘤活性有直接关系。(4)PBPa21主要由半乳糖、葡萄糖与N-乙酰氨基葡萄糖组成,并有少量的甘露糖与3(4)-O-甲基己糖。4双线嗜粘液蛞蝓多糖的硫酸酯化与硒化研究(1)采用三氧化硫-吡啶复合物作为硫酸酯化试剂,制备得到PBPn11的硫酸酯化产物PBPn11SO4,红外和紫外光谱显示产物中含有硫酸酯键的特征吸收峰。经测定,PBPn11SO4中硫酸基质量分数为15.8%,取代度为1.61。(2)利用苯基异硒氰酸酯作为硒化试剂,制备部分硒化和全硒化产物PBPn11Se1和PBPn11Se2。经分光光度法测定,PBPn11Se1和PBPn11Se2中硒含量分别为8.22%和19.53%。5双线嗜粘液蛞蝓多糖的体外活性实验研究(1)对 PBPn1 1、PBPa1 1、PBPa12、PBPa21、PBPn1 1SO4、PBPn11Se1和 PBPn11Se2 七个组分抑制 CHL、MCF-7、Hela、A549、S-180 和 HL-60等细胞增殖作用的研究结果表明,除PBPa12外,其余6种组分都具有抑制作用,抑制效果为:PBPa11>PBPn11Se2>PBPn11Se1>PBPn11SO4>PBPa21>PBPn11,呈剂量依赖性。PBPa11 对 A549、MCF-7、Hela、S-180 和 HL-60 的 IC50值分别为87 μg/mL、440 μg/mL、324 μg/mL、268 μg/mL 和 528 μg/mL。以 CHL作为对照,PBPa11的细胞毒性选择指数SI分别为8.655、1.710、2.324、2.810 和 1.426。PBPn11经硫酸酯化和硒化后抗肿瘤活性有所提高,硒含量增加可提高抗肿瘤活性,但同时也会增加对CHL的抑制。(2)PBPn11、PBPa11、PBPa21、PBPn11SO4、PBPn11Se1 和PBPn11Se2对DPPH自由基、ABTS自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基的清除均具有一定作用。特别是PBPn11Se1和PBPn11Se2的抗氧化活性要普遍高于其它4个组分,证明硒化能有效提高蛞蝓多糖的抗氧化活性。(3)PBPn11、PBPa11、PBPa21、PBPn11SO4、PBPn11Se2 能不同程度的促进脾细胞的增殖,且具有量效依赖性,其中以PBPa11和PBPa21两种糖蛋白的刺激作用最强,对脾细胞的刺激指数分别为2.53和2.48。PBPn11的硫酸酯化和硒化有助于提高对脾细胞增殖的刺激作用。这几种多糖对THP-1中IFN-α的分泌具有较显著的促进作用,其中以PBPa11和PBPa21最为明显。硫酸酯化和硒化能增强多糖对IFN-α分泌的促进作用。