镉(Cadmium)是一种广泛应用于工农业生产的有毒重金属,随着近年来越来越多有关镉污染的报道,人们也越来越关注镉对环境和人类的健康造成的影响。镉能对多个器官系统造成巨大的危害,包括肾、肝、脑、肺、睾丸及血液等。流行病学研究和动物实验研究中明确了镉暴露与多种肿瘤有相关性,尤其是镉与肺癌有明显的关联性,1993年IARC(国际肿瘤研究中心)将镉列为Ⅰ类致癌物。研究表明,许多癌症和肿瘤晚期的转移和恶化可能与肿瘤细胞自噬水平改变有关。自噬通过包裹细胞质内的蛋白质和衰老细胞器形成具有双层膜结构的自噬小体进行降解物质实现循环利用,这一过程受自噬相关蛋白(Atg)的逐级调节,随后自噬体与溶酶体融合后消化膜内容物产生合成大分子和代谢物的物质,为细胞提供能量来源。因此,本研究拟探讨低浓度镉诱导的自噬在镉诱导肿瘤发生中的可能分子机制。本研究拟以人肺腺癌A549细胞为体外实验模型,观察氯化镉对A549细胞的细胞增殖、细胞迁移和侵袭能力的影响;再通过观察细胞周期改变及Cyclin-D1表达、细胞内活性氧水平,自噬形成及相关蛋白的表达、细胞迁移侵袭能力变化及相关蛋白MMP-9蛋白表达,探讨可能的分子机制;并采用活性氧(ROS)的清除剂N-乙酰半胱氨酸NAC和Atg4 siRNA干预处理,进一步明确ROS上调Atg4引起的自噬在氯化镉诱导A549细胞的细胞增殖、细胞迁移和侵袭中的分子机制,为镉诱导肿瘤提供预防和治疗的理论依据。目的:研究低浓度氯化镉对人肺腺癌A549细胞的增殖、细胞迁移和侵袭能力的影响,并探讨依赖细胞内ROS的自噬途径在细胞增殖、细胞迁移和侵袭变化过程中的作用机制。方法:以人肺腺癌细胞(A549细胞)作为实验对象。按实验设计,将不同浓度氯化镉作用于A549细胞,应用MTT法测定A549细胞增殖率和不同实验干预剂NAC、3-MA和Atg4 siRNA预处理后氯化镉作用于A549细胞增殖率的变化。分别采用透射电镜和荧光显微镜测定A549细胞的自噬水平和自噬溶酶体膜电位的变化。用荧光显微镜观察经Cyto-ID?Green染色的自噬小体绿色荧光强度的改变。用2’,7’-二氯荧光素二乙酸盐(DCFH—DA)染色法,在荧光显微镜下观察氯化镉处理后A549细胞内活性氧(ROS)含量的变化,并用NAC预处理2小时,以明确细胞内ROS在氯化镉诱导细胞自噬和增殖中的作用。应用Transwell实验检测氯化镉作用后A549细胞的迁移和侵袭的能力改变。用流式细胞仪检测实验设计中不同实验处理组A549细胞生长周期的变化。运用RNA干扰(RNAi)技术,敲除A549细胞自噬相关基因4(ATG4),检测氯化镉所诱导的细胞自噬对细胞增殖、迁移和侵袭的影响。用蛋白印迹法(Western Blot)检测本实验中自噬标志蛋白LC3蛋白、自噬相关蛋白Beclin-1和Atg4蛋白、细胞周期蛋白Cyclin D1以及MMP-9蛋白的表达量。用SPSS 17.0统计软件对实验数据进行统计分析。结果:低浓度氯化镉作用A549细胞48小时后,诱导A549细胞的细胞增殖(P<0.01),细胞周期结果显示氯化镉处理组S期和G2/M期细胞百分比例显著增加,G0/G1期细胞比例减少(P<0.05)。电子显微镜观察结果显示形成自噬小体数量增加,荧光显微镜观察经Cyto-ID?Green染色的A549细胞自噬小体荧光强度增强,迁移和侵袭细胞数量增加,并且具有统计学意义。低浓度(2μM)氯化镉作用于A549细胞后,细胞内ROS含量增加,NAC预处理降低了氯化镉诱导的细胞内ROS水平的升高,表明氯化镉引起了A549细胞氧化应激反应,同时,NAC可以有效的抑制氯化镉的促增殖作用和下调由氯化镉诱导表达增加的自噬相关蛋白LC3和Atg4的表达量,表明氯化镉通过氧化应激诱导了细胞自噬和细胞增殖;自噬抑制剂3-MA和Atg4 siRNA不仅能够拮抗氯化镉作用诱导的自噬增加效应,还抑制了氯化镉对A549细胞的促增殖、迁移和侵袭能力,表明Atg4介导的自噬在氯化镉诱导的A549细胞的细胞增殖、迁移和侵袭中发挥了重要作用。结论:低浓度氯化镉通过诱导A549细胞内ROS水平升高、上调了Atg4蛋白表达而诱导了自噬,自噬在氯化镉引起的A549细胞的细胞增殖、细胞迁移和侵袭中发挥了重要作用。