类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis, RA）是风湿科常见疾病,其以多种自身抗体阳性,骨、软骨破坏以及多器官系统受累为特征,其病理特征为关节滑膜组织增生（血管翳形成）伴异常血管增生。滑膜细胞异常增殖和血管异常增生导致的血管翳是其发病机制中的重要环节。低氧-血管内皮生长因子-促血管生成蛋白因子系统（Hypoxia-vascular endothelial growth factor（VEGF）-angiopoietin system）是目前类风湿关节炎血管形成机制中广泛研究的血管形成通路。本研究建立类风湿关节炎内皮细胞模型,并探讨Gaq家族成员GNA11、GNA14在内皮细胞模型中的表达及功能学作用。本课题研究内容分为以下两部分：第一部分：内皮细胞模型的确立及内皮细胞低氧-炎症模型中GNA11、GNA14蛋白表达的变化第二部分：Gαq家族成员GNA11、GNA14对VEGF介导的内皮细胞功能的影响第一部分内皮细胞模型的确立及在内皮细胞低氧-炎症模型中GNA11、GNA14蛋白表达的变化背景低氧是调节血管功能的重要因素。组织细胞通过氧敏感转录因子低氧诱导因子（hypoxia inducible factor, HIF）等感知氧压变化,进而产生适应性变化。低氧与很多疾病状态相关,如肿瘤、炎症、自身免疫性疾病等。在类风湿关节炎血管形成研究领域中,低氧-血管内皮生长因子-促血管生成蛋白因子系统（Hypoxia-vascular endothelial growth factor（VEGF）-angiopoietin system）具有重要地位。局部和／或系统性炎症可形成缺氧环境。缺氧可介导病理性血管生成,新生血管通过持续向病变滑膜处运送炎症细胞,同时为血管翳提供营养支持,从而实现慢性炎症状态。因此,进一步研究类风湿关节炎病理性血管增生机制,对于打断慢性炎症状态这一异常的“平衡”状态对于类风湿关节炎治疗有研究价值。材料和方法1.细胞培养胶原酶消化法后获得原代人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cell, HUVEC）,悬浮于含有10%胎牛血清、30mg/L ECGS （Endothelial cell Growth Supplement）、100mg/L Heparin的RPMI1640培养液中接种于60mm细胞培养皿中。6小时后换液弃去未贴壁细胞,隔日再换液。长至85-95%可传代或冻存。2.低密度脂蛋白摄取实验标记HUVEC取原代培养的HUVEC,～80%融合时行低密度脂蛋白摄取实验。HUVEC原代培养中常发生血管平滑肌细胞及成纤维细胞污染。血管平滑肌细胞及成纤维细胞无摄取LDL的功能。因此本实验可用于原代培养HUVEC的初步筛选。低密度脂蛋白（Dil-Ac-LDL）试剂具有荧光标记,荧光显微镜下观察荧光标记情况。3.流式细胞仪分离获取CD31阳性表达的细胞选用CD31抗体标记内皮细胞,利用流式细胞技术鉴定、筛选并纯化原代分离的HUVEC。4.IL-6和IL-8对]HUVEC功能的影响取生理及病理高浓度IL-6和IL-8刺激HUVEC。以活-死细胞染色方法（Live/Dead Cell Staining）测定其对HUVEC增殖功能的影响。细胞迁移实验在24孔穿膜系统（24-multiwell FluoroBlok Transwell insert system, BD Falcon）中操作。5. HUVEC低氧-炎症模型制作低氧状态下培养HUVEC,模拟类风湿关节炎病理状况下内皮细胞,制作低氧-炎症模型。HUVEC细胞培养于3%O2,5%CO2,37℃低氧培养箱。通过调节N2浓度实现低氧环境。细胞培养全部步骤均在内操作。6.GNA11、GNA14在HUVEC低氧-炎症模型中蛋白水平表达的变化HUVEC培养至第3代,取常氧培养（空气,-20%O2）下HUVEC为对照。Western Blot检测(GNA11、GNA14表达。结果1. HUVEC形态观察原代人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cell, HUVEC）培养呈单层、多细胞集落。伴随细胞生长,集落增大并融合成片。细胞互不重叠,呈典型“铺路石”样排列。2. HUVEC筛选及纯化HUVEC初步筛选采用Dil-Ac-LDL摄取实验。荧光显微镜下观察Dil-Ac-LDL摄取细胞>99%。流式细胞仪分析CD31阳性率>99%,继续分离获取CD31阳性表达的细胞,并确立为HUVEC细胞株。3.IL-6和IL-8对HUVEC功能的影响IL-6和IL-8在生理浓度下（10ng/ml）具有促进HUVEC增殖功能,与对照组相比具有统计学差异,p≤0.05。病理浓度下（100ng/ml）,IL-6和IL-8亦具有促进HUVEC增殖功能,与对照组相比具有统计学差异,p≤0.05。IL-8在100ng/ml可抑制HUVEC细胞迁移,与对照组相比具有统计学差异,p≤0.05。4. GNA11、GNA14在HUVEC低氧-炎症模型中蛋白水平表达的变化Western blot检测结果表明GNA11和GNA14表达于HUVEC,分子量大小为～42kD,与阳性对照结果一致。GNA14在低氧下表达高于正常氧压对照,其相对表达量为1.63±0.25,具有统计学差异,p≤0.05。GNA11在低氧下相对表达量为1.11±0.15,与对照相比无统计学差异。结论1. HUVEC具有结构完整、高纯度和高生物活性的特点。HUVEC细胞原代培养及分离方法有效。2.IL-6和IL-8参与调控HUVEC细胞增殖、迁移功能。3.在类风湿关节炎低氧-炎症内皮细胞模型中GNA14呈高表达。第二部分Gαq家族成员GNA11、GNA14对VEGF介导的内皮细胞功能的影响背景血管生成（Angiogenesis）是指从已有的毛细血管或毛细血管后静脉发展而形成新的血管,主要包括：激活期血管基底膜降解；血管内皮细胞的激活、增殖、迁移；重建形成新的血管和血管网,是涉及多种细胞的多种分子的复杂过程。血管形成是在促血管形成因子和抑制因子协调下进行的,正常情况下二者处于平衡状态,一旦此平衡打破就会激活血管系统,使血管生成过度或抑制血管系统是血管退化。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）是类风湿关节炎发病机制中最重要的促血管生成因子。研究表明,VEGF表达于类风湿关节炎患者滑膜组织,且在类风湿关节炎患者血清中水平增高。VEGF表达水平与类风湿关节炎疾病活动度呈正相关。VEGF在动物关节炎模型中亦呈高表达,抗VEGF治疗对动物关节炎模型有治疗效应。VEGF是类风湿关节炎病理性血管生成的主要促进因子,其介导病理性血管生成,新生血管通过持续向病变滑膜处运送炎症细胞,同时为血管翳提供营养支持,使之处于持续慢性炎症状态。因此,深入研究类风湿关节炎病理性血管增生机制,对于研究类风湿关节炎的发病机制并且对治疗有重要的意义。既往研究证明,VEGF参与调控内皮细胞多种功能,如增殖,迁移和血管扩张因子的产生。VEGF对内皮细胞的活性功能主要通过一系列蛋白酶介导,如ERK1/2, Akt1,and p38MAPK,也通过G蛋白（G protein）介导。G蛋白偶联受体（G protein coupled receptors, GPCRs）为异三聚体,由α,β和γ亚单位组成。作为在哺乳动物细胞中分布最广泛的膜表面蛋白,其偶联介导多种细胞功能。G蛋白偶联受体和/或G蛋白功能异常可导致自身免疫病、高血压、肿瘤等多种疾病。GNA11和GNA14属α亚单位中Gaq家族。Gaq家族参与多种调节内皮细胞功能的跨膜和胞内信号传导系统,包括VEGF、磷脂酶C、ERK1/2、Akt1和Ca++等。因此,探索VEGF在类风湿关节炎发病机制中的作用,并寻找对应的治疗方案对类风湿关节炎的诊疗具有重要临床意义。本研究选用HUVEC作为体外实验研究工具,探讨GNA11、GNA14对VEGF介导的内皮细胞功能的影响。材料和方法1.人GNA14抗体的设计制作及特异性验证根据人GNA14基因号码（GenBank#NM₀04297）查询人GNA14核苷酸序列设计2条肽段用于免疫兔。抗体经亲和层析纯化。取HUVEC细胞裂解液及阳性（GNA14过表达293T cells, sc-174410, Santa Cruz Biotech）、阴性（GNA11过表达293T cells, sc-120367）对照,行SDS-PAGE胶电泳,Western Blotting方法检测确定抗体特异性。2. GNA11, GNA14在体外培养HUVEC中的表达。免疫组织化学法检测(GNA11,GNA14蛋白在体外培养的HUVEC中的表达。HUVEC以10,000/孔的浓度接种于8孔Lab-Tek Chamber Slide（玻璃载玻片）。24h后以PBS冲洗后再以4%的多聚甲醛固定。储存于70%乙醇。过氧化物酶淬火后加血清封闭。依次加入抗体孵育,PBS冲洗。以AEC显色,以水性封片剂封片。3. GNA11, GNA14siRNA对HUVEC GNA11和GNA14蛋白表达的影响脂质体法转染siRNA。GNA11siRNA终浓度为20nM, GNA14siRNA终浓度为60nM。设时间梯度。留取细胞以Western Blot方法检测GNA11, GNA14siRNA对GNA11和GNA14蛋白表达的影响。4.GNA11, GNA14siRNA对经VEGF刺激的HUVEC迁移功能的影响细胞迁移实验采用Transwell chamber system,24-well,8.0um pore membranes （Corning）。HUVEC以GNA11或GNA14siRNA预处理。GNA11siRNA终浓度为20nM, GNA14siRNA终浓度为60nM。分别经GNA11siRNA2d, GNA14siRNA4d处理后,经血清饥饿操作6小时后胰酶消化HUVEC细胞,以30,000/孔的浓度种于预加VEGF于底孔的Transwell chamber system上孔。24小时后以CalceinAM染色细胞,并于荧光显微镜下观察已穿膜迁移的内皮细胞。结果1.人GNA14抗体检测rGNA14Ab以Western blot方法检测。取HUVEC细胞裂解液及阳性（GNA14过表达293T cells, sc-174410, Santa Cruz Biotech）、阴性（GNA11过表达293Tcells, sc-120367）对照行SDS-PAGE胶电泳并转膜。rGNA14Ab在分子量41.6kDa处检测到单一条带,相同分子量大小条带出现在阳性对照组,阴性对照组无条带出现。该结果证实rGNAHAb特异性。2. GNA11, GNA14表达于体外培养HUVEC在Chamber Slide载玻片以rGNA14Ab （4ug/ml）, GNA11antibody （2ug/ml, sc-394, Santa Cruz Biotech） or preimmune IgG (4ug/ml, a negative control染色。结果显示,GNA11,14均表达于HUVEC。3. GNA11, GNA14siRNA分别抑制HUVEC GNA11和GNA14蛋白表达GNA11, GNA14siRNA分别抑制GNA11和GNA14蛋白水平表达。GNA11siRNA转染2d后GNA11蛋白水平抑制率为92%。GNA14siRNA转染4d后GNA14蛋白水平抑制率为70%。4. GNA11, GNA14参与VEGF介导的HUVEC迁移功能GNA11siRNA和GNA14siRNA抑制VEGF介导的细胞迁移。结论1.首次验证GNA14在HUVEC中表达。2. GNA11, GNA14参与VEGF介导的HUVEC细胞迁移功能。