近年来,由于艾滋病、恶性肿瘤、自身免疫疾病、糖尿病等导致免疫受损疾病的发病率增高,侵入性真菌感染(尤其是肺部、尿道和肠道深部感染)发生率不断增加,对人类健康造成了极大危害。伊曲康唑(itraconazole, ITZ)是1988年投放市场的三唑类新型广谱抗真菌药,临床疗效好,应用广泛，长期以来国内临床应用大都依靠进口的ITZ(商品名斯皮仁诺)胶囊剂和注射液。ITZ水溶性差,胶囊剂口服后药物吸收不稳定且血药浓度波动大,难以维持有效治疗浓度；ITZ注射液采用包合技术增加ITZ的溶解度,处方中使用了总量大约40%的HP-β-CD作为包合物材料,HP-β-CD主要经肾脏消除,一方面导致肾脏蓄积中毒,另一方面,长期应用有潜在的致癌作用。因此,开发一种低毒、高效的新型伊曲康唑静脉注射制剂成为研究的重点。脂质体(liposomes)是以磷脂、胆固醇为载体材料、可供静脉注射用的新型给药系统。磷脂和胆固醇均为人体内源性物质,对人体无毒无害,已经被FDA批准为药用辅料,目前已有抗真菌药两性霉素B脂质体上市应用于临床。羧甲基壳聚糖(CMC)是壳聚糖的水溶性衍生物,具有生物可降解性、生物相容性、低毒性等特点,将CMC用于脂质体修饰,在脂质体膜表面形成一层致密亲水层,可增加对血浆蛋白的排斥作用,减少巨噬细胞的识别和吞噬,使脂质体在动物体内的循环时间延长。本课题以ITZ为模型药物,以磷脂、胆固醇等作为载体材料,采用薄膜分散法制备ITZ普通脂质体,利用正负电荷吸附进行CMC修饰,得到可供静脉注射用的ITZ修饰脂质体。研究内容主要包括普通脂质体和修饰脂质体的制备及理化性质研究、脂质体的体外抗真菌活性研究、初步安全性评价和体内药物动力学和组织分布学研究。1.ITZ普通脂质体的制备与理化性质研究采用过滤法分离脂质体和游离药物,紫外分光光度法测定ITZ的含量,并对含量测定和包封率测定方法进行考察；以包封率为评价指标,选取ITZ普通脂质体的最佳制备方法,分别对工艺因素和处方因素进行单因素考察,通过正交试验设计优化最佳处方和制备工艺；采用电子透射显微镜观察脂质体的外观形态,激光粒度分析仪测定粒径和粒度分布,表面电位分析仪测定Zeta电位,pH计测定脂质体混悬液的pH值。实验结果表明,采用过滤法可以将脂质体与未包封的药物结晶完全分离,回收率符合测定要求,紫外分光光度法测定ITZ的含量,辅料不干扰测定,专属性强,方法灵敏简便；薄膜分散法制备ITZ普通脂质体可以获得较高的包封率,最佳工艺为探针超声功率为500w,时间为15s,最佳处方为卵磷脂与胆固醇的投料比为12：1(gg)、药／脂比为1：20(gg),水合介质与有机溶剂之比为1:4(v/v),DSC法验证脂质体确已形成,外观为乳白色,透射电镜下呈类球形,粒度分布均匀,平均粒径为(170.1±15)nm,Zeta电位为(-9.39±0.75)mV,pH值为7.38±0.07；三批重现性实验结果表明,ITZ普通脂质体处方组成合理,工艺稳定。2.羧甲基壳聚糖修饰ITZ脂质体的制备与理化性质研究采用过滤法分离修饰脂质体和游离药物,紫外分光光度法测定ITZ的含量,并对含量和包封率测定方法进行考察；对普通脂质体进行羧甲基壳聚糖包衣,分别考察十八胺的用量和羧甲基壳聚糖的浓度对修饰效果的影响；采用电子透射显微镜观察修饰脂质体的外观形态,激光粒度分析仪测定粒径和粒度分布,表面电位分析仪测定Zeta电位,pH计测定修饰脂质体混悬液的pH值。实验结果表明,采用过滤法可以将修饰脂质体与未包封的药物结晶完全分离,回收率符合测定要求,紫外分光光度法测定ITZ的含量,辅料不干扰测定,专属性强,方法灵敏简便；十八胺用量为2.5%、羧甲基壳聚糖浓度为0.2%时修饰效果最好；修饰脂质体外观为乳白色,透射电镜下呈类球形,粒度分布均匀,粒径较普通脂质体增大,平均粒径为(349.3±18)nm,Zeta电位为(-35.71+0.62)mV,pH值为7.94+0.13,三批修饰ITZ脂质体重现性实验结果表明,处方组成合理,工艺稳定。3.体外抗真菌活性研究和初步安全性评价依照标准化委员会(NCCLS)建立的真菌敏感性测定方案(M27-A方案),采用微量稀释法,以真菌中比较有代表性的白色念珠菌作为试验菌测定实验菌株对ITZ脂质体的敏感性；通过体外溶血试验和血管刺激性试验对制剂的初步安全性进行考察。实验结果表明,本文制备的羧甲基壳聚糖修饰ITZ脂质体保持了较强的抗菌活性,体外抑菌作用未因药物包封而受到影响；受试品无溶血和血细胞凝集现象,静脉注射期间和恢复期均无刺激性,使用安全。4.小鼠体内药物动力学及组织分布动力学研究采用HPLC法测定小鼠血浆和组织中ITZ的含量并对其方法学进行考察；以ITZ注射溶液作为对照,研究了ITZ普通脂质体和羧甲基壳聚糖修饰的ITZ脂质体在小鼠体内的药物动力学和组织分布动力学；以相对摄取率(Re)、相对靶向效率(Te)、Ce等靶向性参数为指标,对脂质体的组织靶向性进行了评价。实验结果表明,在所选用的色谱条件下,用HPLC法测定小鼠体内血浆和组织中的ITZ,内源性物质不干扰药物测定,标准曲线、精密度和回收率均符合测定要求；与上市注射液相比,普通和修饰脂质体在血浆中的MRT分别由4.706h延长到13.479h和17.432h,AUC也分别由6.427mg/L*h增加到13.479mg/L*h和17.432mg/L*h;普通脂质体药物在肝、脾的分布增加,AUC分别由139.150μg/g*h和48.821μg/g*h增加到192.007μg/g*h和230.059μg/g*h,修饰脂质体较普通脂质体有所下降,分别为134.284μg/g*h和180.285μg/g*h;药物在肺部分布明显增强,普通脂质体组较溶液组相比,AUC由102.955μg/g*h提高到222.309μg/g*h,修饰脂质体在肺部的靶向性进一步增加,相对摄取率由2.159增加到4.243,靶向效率由27.31%增加到49.71%；药物在心肾的分布进一步降低,与注射液组相比,普通脂质体和修饰脂质体心脏的Te分别由13.54%降低到7.42%和5.96%,肾脏的Te分别由31.14%降低到11.09%和5.32%,Cmax也明显降低,有利于降低这些部位的毒副作用。结论：本课题成功研制了羧甲基壳聚糖修饰的ITZ脂质体,制备工艺简单易行,重现性好,包封率高,理化性质符合注射要求；体外抑菌实验结果表明,羧甲基壳聚糖修饰的ITZ脂质体抑菌效果较好,无溶血现象,静脉注射无刺激性；小鼠体内实验结果表明,羧甲基壳聚糖修饰的ITZ脂质体延长了药物的体内循环时间,增加了真菌易感染部位如肺脏的药物浓度,降低了药物在心、肾的浓度,减小了心、肾组织的毒副作用,为临床应用提供了可靠的理论依据。