坛紫菜(Porphyra haitanensis)中抑菌活性多肽的分离、初步纯化及其作用机理研究

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本文就坛紫菜(Porphyra haitanensis)中具有抑菌活性的蛋白质酶解物进行了筛选和活性多肽初步纯化,并对其进行了作用机理研究。研究结果表明:坛紫菜水溶性蛋白质胃蛋自酶3h酶解塑对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的生长有明显抑制作用,将金黄色葡萄球菌确定为指示菌种。上述酶解物依次经过Labscale小型切向流超滤、Bio-Gel P-10凝胶过滤和DEAE Sephadex A-50阴离子交换层析进行纯化,最终得到一个分子量段在42.9KD~80.7KD、对金黄色葡萄球菌的生长有明显抑制作用的混合多肽(DSA-1)。进一步研究发现,高温、储存时间过长、碱性环境和维生素E均降低DSA-1对金黄色葡萄球菌生长的抑制能力,而EDTA、维生素C、柠檬酸和DMSO会增强DSA-1对金黄色葡萄球菌生长的抑制能力,紫外线和金属离子K+、Na+、Ga2+、Mg2+、Fe2+对DSA-1抑制金黄色葡萄球菌生长的能力没有影响;通过对金黄色葡萄球菌生长曲线和菌落形态的研究,发现DSA-1可以抑制金黄色葡萄球菌在对数分裂期的菌体分裂,影响其菌落形态;研究经DSA-1处理的金黄色葡萄球菌培养液中物质含量的变化,发现在培养液中检测到碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶的活性和紫外吸收物的存在,并且培养液电导率值增加,说明DSA-1可能损伤了金黄色葡萄球菌菌体细胞壁和细胞质膜,致使菌体细胞质膜通透性增加,大量胞内物质外泄;扫描电镜结果显示经DSA-1处理的金黄色葡萄球菌菌体形态逐渐变得不规则,菌体细胞表面变的粗糙,菌体细胞大多呈单个分散分布,最后大量的菌体细胞粘连成团块状;透射电镜结果进一步显示在DSA-1的作用下,金黄色葡萄球菌菌体细胞壁和细胞质膜的完整性逐渐遭到破坏,细胞质逐渐分解固缩,胞内空腔逐渐变大,最终菌体细胞破碎;经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,DSA-1可以导致金黄色葡萄球菌菌体全蛋白谱带中某些蛋白谱带的缺失,剩余蛋白谱带也随着DSA-1处理时间的延长而逐渐变得模糊不清。因此,推测DSA-1对金黄色葡萄球菌生长的抑制作用机理可能是:DSA-1破坏了金黄色葡萄球菌菌体细胞壁和细胞质膜,增强了细胞质膜通透性,导致大量胞内物质外泄,同时DSA-1也可能进入菌体细胞内部,抑制菌体细胞某些蛋白质的合成或者降解菌体细胞某些蛋白质。
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