研究目的肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一,可分为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)两大病理类型,其中非小细胞肺癌约占肺癌总数的80%以上,包括鳞癌,腺癌,腺鳞癌等多种组织学类型。肺癌是一种异质性疾病,近年来的研究发现其发生发展过程中存在多种基因的表达调控异常,参与肿瘤细胞周期、生长分化、细胞移动和凋亡等多种生物学过程。研究与肺癌相关的新基因对揭示其发病机制和进行干预治疗有重要价值。TIPE2,即肿瘤坏死因子a诱导蛋白8-2(Tumor necrosis factor-α induced protein-8-like2, TNFAIP8L2),是一种新型的免疫负调控基因。在小鼠中TIPE2选择性表达于免疫器官和淋巴组织。我们课题组前期研究发现人TIPE2除表达于免疫细胞外,还表达于多种非免疫组织器官,如,肝细胞,复层鳞状上皮细胞及某些腺上皮细胞等。TIPE2蛋白在大量非免疫细胞中的表达提示其除了具有免疫调节作用外还可能具有其他功能。近期研究发现,TIPE2能够特异性与RGL结合,阻断RAS信号通路的活化,进而对细胞的生长,迁移发挥重要的抑制作用,同时发现人TIPE2在肝癌中的表达显著低于在癌旁组织,从而推测TIPE2可能具有抑癌功能。随后又有发现TIPE2能够抑(?)PI3K-Rac信号通路的活化,从而调控由RNA引起固有免疫应答过程。同年该研究组又提出,TIPE2能够通过其N端的赖氨酸或精氨酸残基(Lys-15, Lys-16和Arg-24)特异性的与Rac1蛋白C端的CAAX模体结合,从而抑制Racl蛋白及其下游信号通路的活化。Rac属于Rho家族小GTP酶,是调节肌动蛋白重组和板状伪足形成的主要效应分子,在细胞的运动过程中发挥重要的调节作用,那么TIPE2是否会通过调节Racl信号通路从而影响细胞的运动能力,发挥抑癌基因的功能呢?目前还没有相关研究报道。TIPE2基因在各种类型的癌症特别是肺癌中的作用情况如何,还尚没有研究报道。为了探讨TIPE2在非小细胞肺癌中的表达状态及其功能机制,本论文从临床病例到体外细胞模型,系统的研究了TIPE2在肺癌中的表达及功能。研究方法1. Realtime PCR的方法检测TIPE2在肺癌及癌旁组织中的表达从齐鲁医院收集肺癌手术中切除的肺癌组织及癌旁组织标本(n=7),抽提RNA并进行逆转录,通过Realtime PCR的方法从RNA水平上检测TIPE2的表达变化。2. Western-blot的方法检测TIPE2在肺癌及癌旁组织中的表达将肺癌及癌旁组织分别抽提蛋白进行Western-blot,检测肺癌及癌旁中TIPE2蛋白的表达情况。3.免疫组织化学检测TIPE2在肺癌及癌旁中的表达利用人类非小细胞肺癌组织芯片,通过免疫组化的方法检测各种组织学类型的肺癌及癌旁组织中TIPE2在蛋白水平的表达情况。4.CCK8法检测细胞增殖能力将A549或H1975两种肺癌细胞系接种于96孔板中,对数生长期时,分别转染空载体(PRK5-MOCK)和含人全长TIPE2的重组载体(PRK5-TIPE2),于转染Oh、24h和48h,用酶标仪检测吸光度(A)。5.克隆形成实验将A549或H1975两种肺癌细胞系接种于24孔板中,对数生长期时转染质粒,在转染24h时,将细胞用胰酶消化,以适当密度接种于六孔板中,静置培养10天,1%由甲醇稀释的结晶紫染色,显微镜下计数≥50个细胞的克隆数,计算克隆形成数。6.迁移及侵袭力实验将质粒转染A549或H1975细胞24小时后,分别接种于未铺或铺(?)natrigel的Transwell小室中,培养12-20h用于迁移检测,或培养24-48h用于侵袭检测,用湿棉棒轻轻擦去上室中细胞,固定,小室膜风干,结晶紫染色,用流水冲干净,显微镜下计数10个高倍镜视野,计算整个小室膜上穿膜细胞数。7.基因测序：调取肺癌细胞系中的TIPE2基因并进行测序,与TIPE2质粒和基因库中TIPE2基因序列进行比对,检测肺癌中内源性的TPE2是否发生基因改变。8.小干扰体系的构建设计并合成TIPE2基因的小干扰RNA,将A549或H1975两种肺癌细胞系接种于24孔板中,对数生长期时转染Negative control和SiRNA-TPE2,在转染24h时,将细胞用胰酶消化,分别接种于未铺或铺matrigel的24孔板中进行细胞迁移和侵袭实验检测。9.统计分析不同组织学类型的肺癌病例,其肿瘤组织与相应的癌旁组织TIPE2蛋白的差异表达：采用非配对t检验；TIPE2在肺癌中的表达与临床参数统计分析：采用Spearman相关分析。结果一、TIPE2在肺癌和癌旁组织中的表达及临床意义1. Realtime PCR结果显示,肺癌组织与癌旁组织中TIPE2的RNA表达水平并无显著差异。2. Western-blot检测发现肺癌组织中的TIPE2表达水平显著高于癌旁组织。3.对75例肺癌组织芯片进行免疫组化检测发现,TIPE2在肺癌中的表达要明显强于其相应癌旁组织。TIPE2主要表达在肺癌鳞状或腺状上皮组织的细胞浆内,少数表达在核内。4.尽管统计结果显示TIPE2在肺癌中的表达与患者的性别,年龄,组织类型,及肿瘤大小等均无明显的相关性,但仔细分析发现,在某些低分化(病理分级为Ⅲ级)的肺癌组织局部,鳞状或腺状上皮组织结构消失,细胞形态混乱并有单细胞迁出现象,此时TIPE2表达降低甚至缺失,提示TIPE2可能与肺癌的晚期侵袭和迁移过程相关。二、外源性TIPE2过表达对肺癌细胞恶性行为的影响1. TIPE2过表达对肿瘤细胞生长无影响：为了研究TIPE2对肝癌细胞生长的影响,我们选取A549或H1975细胞,转染MOCK和TIPE2质粒,通过CCK8法检测在Oh、24h和48h的吸光度,结果显示两组细胞其CCK8值在各时间段均无显著差异,说明TIPE2基因对肺癌细胞的生长无明显影响。2. TIPE2过表达可抑制肿瘤细胞克隆形成能力：克隆形成实验检钡TIPE2对肺癌细胞克隆形成能力的影响。研究发(?)TIPE2具有抑制肺癌细胞克隆形成的能力。3. TIPE2过表达明显抑制肺癌细胞的迁移和侵袭能力：我们利用Transwell系统和Transwell小室上铺matrigel基质胶在体外进一步检测了TIPE2对肺癌细胞迁移和侵袭能力的影响。结果发现过表达TIPE2的肿瘤细胞其迁移和侵袭能力明显降低。该结果说明TIPE2基因能够抑制肺癌细胞的迁移和侵袭。三、TIPE2沉默表达对肺癌细胞功能的影响1.内源性基因没有发生变异：基因测序结果显示肺癌细胞内源性的TIPE2基因序列没有发生基因改变。2. TIPE2沉默表达促进细胞迁移和侵袭：为了进一步确定肺癌中内源性TIPE2的功能,我们将肺癌细胞系转染TIPE2基因小干扰序列(Si-TIPE2),沉默内源性的TIPE2表达,之后检测肺癌细胞的迁移和侵袭能力是否发生改变。结果显示,沉默内源性的TIPE2表达后,肿瘤细胞的迁移和侵袭能力明显增强。该结果说明肺癌中内源性的TIPE2同样发挥抑癌基因的功能。四、TIPE2通过影响Racl信号通路从而发挥其抑癌功能1.转染Racl结合区突变的TIPE2载体(MUTANT)组与转染TIPE2质粒组相比,肺癌细胞的克隆形成能力显著增强,并恢复到转染MOCK组水平。2.转染MUTANT载体组与转染TIPE2质粒组相比,肺癌细胞的细胞迁移能力显著增强,并恢复到转染MOCK组水平。3.转染MUTANT载体组与转染TIPE2质粒组相比,肺癌细胞的细胞侵袭能力显著增强,并恢复到转染MOCK组水平。结论1.TIPE2蛋白在肺癌中的表达水平显著高于相应癌旁组织,而在RNA水平上表达无差异,提示TIPE2在肺癌中的表达调控是从翻译水平上进行的。2. TIPE2基因能明显抑制肺癌细胞的克隆形成和迁移、侵袭能力,表现出抑癌基因的功能。3. TIPE2在肺癌中发挥其抑癌功能,是通过调节Rac1信号通路来实现的。创新性及意义1.本研究首次提出尽管TIPE2在肺癌中高表达,但体外实验发现TIPE2能够通过抑制Rac信号通路从而影响肺癌的克隆形成,迁移和侵袭,表现出抑癌基因的功能。2.首次证实TIPE2不仅具有免疫负调控作用,而且具有抑癌基因的功能,研究结果对TIPE2功能的揭示和肺癌发病机制的研究具有重要的理论价值和潜在的应用价值。局限性1.本研究由于芯片病理量有限,临床分级主要集中在Ⅱ级,只有少量Ⅲ级患者,因此不能对TIPE2表达与临床分级进行准确的相关性分析。2.由于研究时间限制,TIPE2通过Rac1影响肺癌细胞恶性行为的具体信号通路还需后续实验继续研究证实。研究目的程序性细胞死亡-4(Programmed cell death4, PDCD4)是1995年科学家在研究细胞凋亡时从小鼠细胞中发现的凋亡相关基因。现已证实它是一种蛋白翻译抑制分子,能够通过其MA-3功能域与真核细胞翻译起始因子eIF4A结合,从而抑制多种蛋白的合成。我们和其他学者的研究发现,PDCD4能够在人多种肿瘤的发生发展中发挥重要的抑制作用,从而该基因被定义为一种新的抑癌基因。而近年来许多研究发现PDCD4不仅具有抑癌作用,还与炎症的发生相关,那么PDCD4基因对免疫细胞的影响如何呢?目前还没有明确的研究报道。T细胞是机体发挥适应性免疫应答的主要效应细胞,而树突状细胞(DC)是最重要的抗原递呈细胞,这两种免疫细胞在机体的免疫反应和调节中相互配合,共同发挥其免疫学功能,维护免疫系统的稳态。本研究的目的是通过研究PDCD4基因对T细胞和DC分化的影响,从而为PDCD4在炎症性疾病中的作用机制提供理论依据,本课题从以下两个方面进行了研究：一、PDCD4基因对T淋巴细胞亚群分化的影响：利用PDCD4基因敲除小鼠与野生型小鼠对比,检测PDCD4基因缺失后脾脏和淋巴结中的各T细胞亚群的分化比例是否发生变化。二、PDCD4对骨髓来源的树突状细胞分化的影响：首先通过骨髓诱导的方式体外诱导获得DC,然后比较Pdcd4-/-和C57BL/6两种小鼠来源的DC的表型特征以及细胞因子和NO分泌是否有所差异。研究方法一、PDCD4基因对T淋巴细胞亚群分化的影响1.分离Pdcd4-/-和C57BL/6两组小鼠的脾脏和淋巴结,分别制备单细胞悬液。2.用流式细胞术检测两组小鼠来源的脾脏和淋巴结中CD8+T、CD4+T以及CD4+T细胞亚群Th1、Th2、Th17和CD25+Foxp3+Treg细胞的比例差异。二、PDCD4对骨髓来源的树突状细胞分化的影响1.无菌分离Pdcd4-/-和C57BL/6两组小鼠的骨髓细胞,在细胞因子IL-4和GM-CSF的作用下诱导DC的分化,诱导六天获得未成熟DC,于第七天加入LPS刺激24小时即获得成熟DC。2.流式细胞术检测PDCD4基因缺失后是否对DC的分化及表型产生影响。3.分离成熟DC的细胞培养上清,利用ELISA以及细胞因子流式微球试剂盒检测两组DC培养上清中炎性因子TGF-β以及IL-6, IL-10, MCP-1, IFN-γ, TNF-α和IL-12的浓度差异；4.利用NO检测试剂盒检测PDCD4基因缺失后是否影响DC中NO的分泌；5.收集两组DC,抽提RNA和蛋白,利用RT-PCR和Western-blot的方法从转录水平和翻译水平检测PDCD4基因缺失的DC其一氧化氮合酶(iNOS)的表达是否发生变化；结果一、PDCD4基因对T淋巴细胞亚群分化的影响1. PDCD4基因对CD4+T、CD8+T细胞分化的影响流式细胞术对CD8+T和CD4+T细胞标志性分子CD8和CD4表达进行检测,发现PDCD4基因缺失小鼠脾脏及淋巴结中CD8+T细胞比例较C57BL/6小鼠有显著降低,而CD4+T的比例并无显著差异。2. PDCD4基因对CD4+T细胞亚群Thl、Th2和Th17的影响流式细胞术对CD4+T细胞亚群Thl、Th2和Th17表面标志性分子IFN-γ、IL-4和IL-17的表达进行检测,发现PDCD4基因缺失小鼠中Th1、Th2和Th17的细胞比例均无显著变化。3. PDCD4基因对CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg)分化的影响PDCD4基因缺失小鼠较C57BL/6小鼠其脾脏和淋巴结中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg)的比例明显升高。二、PDCD4对骨髓来源的树突状细胞分化发育的影响1. PDCD4基因的缺失对骨髓来源的DC诱导的影响两组小鼠来源的骨髓细胞在诱导六天之后,获得未成熟的DCs,通过流式细胞术对DC特异性表面分子CDllc, CD80, CD86以及MHCII进行检测发现两组DC中其CD11c阳性率均达到百分之七十以上且无统计学差异,说明DC诱导成功,且两组DC中其CD11c, CD80, CD86以及MHCII的表达并无统计学差异,提示PDCD4基因并不能影响未成熟DC的诱导。2. PDCD4基因对DC成熟表型的影响为了检测PDCD4基因是否对DC的成熟有一定的影响,我们利用LPS刺激,使DC分化成熟,并利用流式细胞术检测两组成熟DC其表面分子CD80, CD86以及MHCII表达是否出现差异。结果显示PDCD4基因缺失后并不能影响DC表面协同刺激分子CD80和MHCII的表达,而对CD86的表达具有明显的抑制作用。提示PDCD4能够影响CD86的表达,从而参与DC的表型成熟。3. PDCD4基因对DC细胞因子分泌的影响为了检测PDCD4基因缺失之后DC的细胞因子表达是否受到影响,我们收集成熟DC的细胞培养上清,通过ELISA检测两组上清中TGF-β的表达,结果也并无统计学差异。我们又利用流式细胞微球芯片试剂盒检测两组细胞培养上清中细胞因子(IL-6, IL-10, MCP-1, IFN-γ、TNF-α和IL-12)的表达变化,结果发现两组上清中这六种细胞因子的表达均无显著差异。上述结果说明PDCD4基因对DC细胞因子的分泌并无明显影响。4. PDCD4基因对DC分泌NO的影响我们利用NO检测试剂盒检测了两种DC培养上清中NO的表达情况,结果发现PDCD4基因缺失的DC培养上清中NO的表达量显著高于C57BL/6组,说明PDCD4基因缺失的DC能够表达高水平的NO。5. PDCD4基因对NO合成酶iNOS表达的影响一氧化氮合酶(iNOS)是NO产生的重要的酶类,我们通过RT-PCR从RNA水平检测发现PDCD4基因缺失的DC与野生型DC相比其iNOS的表达并无明显变化；而通过Western-blot检测发现PDCD4基因缺失的DC其iNOS表达水平明显高于野生对照组。这些结果提示PDCD4能够影响iNOS的表达,且其对iNOS表达的调控是从翻译水平上进行的。结论1. PDCD4缺失能够降低外周免疫器官CD8+T细胞的比例但对CD4+T细胞的影响不大；在CD4+细胞中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg)的比例升高,但并不影响Th1、Th2和Th17的比例。这些结果说明PDCD4能够影响部分T细胞亚群的分化。2.尽管.PDCD4基因对骨髓来源的DC的诱导无明显影响；但它能够影响成熟DC的表型,缺失PDCD4的成熟DC表达低水平CD86,且产生高水平的iNOS和NO,提示PDCD4有可能对DC的功能产生一定的影响。创新性和研究意义首次探索了PDCD4基因对免疫细胞—T细胞和DC分化的影响,丰富了对PDCD4基因功能的研究,也为研究PDCD4基因对免疫性疾病的作用提供了实验依据和理论基础。局限性1.由于技术的限制,本论文仅是用敲基因小鼠作为研究对象,没有在PDCD4过表达体系中验证结果。2.由于研究时间有限,本课题侧重于PDCD4影响T细胞和DC分化这一现象的研究,而对具体的影响机制以及对其功能的影响还有待于进一步探讨。