【摘 要】
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目的:为建立人 DC-SIGN双抗体夹心 ELISA方法,制备抗 DC-SIGN兔源多克隆抗体和鼠源单克隆抗体。以制备的多克隆抗体和单克隆抗体为基本检测试剂,进行检测 DC-SIGN的双抗体夹
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目的:为建立人 DC-SIGN双抗体夹心 ELISA方法,制备抗 DC-SIGN兔源多克隆抗体和鼠源单克隆抗体。以制备的多克隆抗体和单克隆抗体为基本检测试剂,进行检测 DC-SIGN的双抗体夹心 ELISA方法。 方法:(1)以 PBMC为模板用RT-PCR方法扩增人 DC-SIGN基因,构建真核表达质粒 pcDNA-DC-SIGN和原核表达质粒 pET28a-DC-SIGN(ER)。(2)用纯化的DC-SIGN胞外区蛋白免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体。通过酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗体效价,免疫荧光法检测其特异性。(3)以纯化的重组人 DC-SIGN胞外区蛋白免疫 Balb/C小鼠,通过细胞融合技术,间接 ELISA筛选和3次以上细胞克隆,获得稳定分泌抗 DC-SIGN蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株,制备单克隆抗体。(4)以获得的多克隆抗体和单克隆抗体为基本检测试剂,进行了双抗体夹心 ELISA方法的探索。 结果:(1)成功构建人 DC-SIGN的原核表达质粒 pET28a-DC-SIGN(ER)和真核表达质粒 pcDNA-DC-SIGN。(2)使用纯化后的重组 DC-SIGN胞外区蛋白免疫日本大耳白兔制备兔抗体 DC-SIGN胞外区蛋白的多克隆抗体。ELISA结果显示,制备的抗体效价达到了1:32000,Western Bloting结果表明,制备的多克隆抗体能特异性与人DC-SIGN重组蛋白结合,具有良好的反应原性。(3)成功获得稳定分泌抗人 DC-SIGN单克隆抗体的杂交瘤细胞株;抗体效价为6.4xl04;免疫印迹实验中,单抗可与细胞内的DC-SIGN蛋白特异地结合;(4)使用多克隆抗体作为包被抗体,以制备的单克隆抗体为检测抗体,建立检测 DC-SIGN的双抗体夹心 ELISA方法模型。 结论:成功制备了人 DC-SIGN多克隆抗体和单克隆抗体,初步建立了检测DC-SIGN的双抗体夹心 ELISA模型。
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