背景:细菌、真菌、病毒广泛存在于人体与外界相通的各个生理腔道,其中,肠道菌群与肿瘤的发生发展研究最为系统,菌群失衡可通过多种途径影响肿瘤的发生发展,致病菌可通过细菌毒素的增加、炎症因子对免疫抑制微环境的重塑、细菌代谢产物或相关酶的作用,影响肿瘤化疗及免疫治疗效果。另外,临床病理检测到共生细菌还存在于乳腺癌、前列腺癌、食管癌、胃癌、肠癌、胰腺癌、肺癌、头颈部肿瘤等内部。肿瘤内浸润的细菌可通过直接或者间接的作用来影响肿瘤的发生发展,比如,具核梭杆菌（Fusobaterium nucleatum,Fn）可通过调节自噬促进结直肠癌对化疗药物的耐药性,牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,Pg）可通过吞服进入到小鼠胰腺组织,并通过改变胰腺癌的免疫微环境促进胰腺癌的发生发展。目前,抗生素是清除致病菌的有效方法之一,但是抗生素全身给药可作用于机体内的多种微生物,易造成肠道内菌群失衡,多样性和丰度难以恢复。与正常组织相比,实体肿瘤组织具有异质性。一方面,肿瘤内血管丰富、结构完整性较差,淋巴回流缺失,通透性增加,这就使得大分子、纳米尺寸的颗粒、脂质体等会选择性的滞留,也就是肿瘤的高通透和滞留效应（Enhanced permeability and retention effect,EPR 效应）;另一方面,肿瘤组织具有 pH 偏酸性、谷胱甘肽（Glutathione,GSH）水平升高、氧含量降低等特点。目的:针对于细菌浸润型结直肠肿瘤的特点,本课题设计将疏水性的抗生素甲硝唑（Metronidazole,MTI）与亲水性的抗肿瘤药物5-氟尿苷（Floxuridine,FDU）纳米化,两者通过二硫键作为桥连键连接成两亲性小分子,通过亲疏水作用在水中自组装为纳米颗粒（MTI-FDU）。研究其在不引起机体正常菌群紊乱的前提下,对细菌浸润型肿瘤的治疗效果及对肿瘤免疫微环境的调节作用。方法:本研究收集了 35例患者的结直肠癌和癌旁正常组织标本,FISH技术检测了两者中Fn的浸润程度,利用免疫组化技术检测了癌和癌旁组织内的细菌代谢产物脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）的水平。通过HPLC、1H NMR、质谱和UV-Vis等方法确认MTI-FDU两亲性分子合成正确,DLS和TEM检测和观察了纳米颗粒的粒径和形貌。分别使用酶标仪检测MTI-FDU纳米药物处理后细菌的吸光度、CLSM拍摄荧光染色的药物处理后生物膜平面和Z轴结构、纸片扩散药敏实验检测纳米药物对细菌生长增殖的抑制作用。CCK-8方法检测纳米药物对肿瘤细胞的抑制作用,Annexin V/PI染色确定纳米药物对肿瘤细胞凋亡的影响,Transwell实验检测纳米药物对肿瘤细胞迁移能力的影响。小动物成像观察纳米药物对肿瘤的靶向能力。构建2个小鼠模型:结直肠癌自发模型（AD/Fn）和结直肠癌腋下肿瘤模型,用于评价纳米药物的抑菌和抑瘤能力。流式细胞术检测小鼠肿瘤内浸润的免疫细胞水平。Elisa技术检测纳米药物对药物治疗后的免疫相关因子的表达水平。免疫组化技术检测TLR4、β-catenin信号通路的变化。结果:相对于肿瘤患者的癌旁组织,结直肠癌组织中Fn浸润水平明显升高,LPS的表达水平上调,Fn浸润水平高的患者生存率下降。本课题成功设计并合成了尺寸为105±38nm的MTI-FDU纳米颗粒的,对肿瘤组织具有很好的靶向性。可在还原性环境下成功释放出原药。在体外水平,对Fn和生物膜均有较好的抑制作用,有抑制结直肠癌细胞增殖、促进其凋亡、抑制其迁移能力的作用。在体内水平,MTI-FDU纳米药物对细菌浸润型的自发性结直肠癌和结直肠癌腋下肿瘤均有明显的抑制作用,可清有效除肿瘤内浸润的细菌,不影响肠道菌群平衡。此外,MTI-FDU纳米药物还可以促进肿瘤内浸润的CD8+T细胞增多、Tregs减少、MDSC减少,使细胞因子IL-6、IL-22、TNF-α下调。在蛋白水平,纳米药物影响通过抑制Fn影响TLR4/β-catenin信号通路,使得肿瘤组织的TLR4表达升高、β-catenin表达降低。结论:本课题成功设计并合成了 MTI-FDU纳米颗粒,对Fn细菌和结直肠肿瘤细胞具有显著的抑制作用。MTI-FDU纳米颗粒优异的抑瘤能力和瘤内细菌清除能力在两种结直肠肿瘤小鼠模型得到了验证,并且不会引起肠道正常菌群失衡。同时,还证明纳米药物通过抑制Fn从而影响TLR4/β-catenin信号通路。另外,纳米药物可以调节肿瘤内抑制性的免疫微环境,逆转Fn引起的免疫细胞和细胞因子水平改变的现象。有望为临床病理明确有瘤内细菌浸润的肿瘤患者提供创新性的治疗药物,开拓肿瘤纳米药物研究的新方向。背景:近年来,大量研宄证明,许多传统的抗癌药物或者靶向药物在杀伤肿瘤的过程中,可以使肿瘤细胞抗原充分暴露,释放损伤相关模式分子（Damage associated molecular patterns,DMAP）,激活DC细胞呈递抗原给细胞毒性T细胞和自然杀伤细胞,调节肿瘤浸润微环境,包括肿瘤微环境内部的细胞组成、因子释放、细胞功能等,从而激活抗肿瘤免疫过程。肿瘤死亡的这一过程称为肿瘤免疫原性细胞死亡（Immunogenic cell death,ICD）。ICD现象发生过程中,释放“eat-me”信号,包含有肿瘤细胞内质网的钙网蛋白（Calretictdin,CRT）迁移至细胞膜表面,细胞核内的高迁移率族蛋白B1（High mobility group protein,HMGB1）释放至细胞质中及细胞外,三磷酸腺苷（ATP）释放等。这些信号的释放是ICD激活机体抗肿瘤免疫的重要起点和标/ill、〇乳糖（Lactose,Lac）及其衍生物可与肝细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体（Asialoglycoprotein receptor,ASGPR）结合将药物递送至细胞内,结合肿瘤的EPR效应,课题组前期设计合成了亲水性乳糖连接疏水性抗肿瘤药物阿霉素（Doxorubicin,DOX）两亲性小分子（Lac-DOX）自组装负载DOX,得到LacDOX/DOX纳米颗粒,可以靶向至肝癌组织的,并在肝癌偏酸性环境下响应释药,取得了优异的肿瘤治疗效果。目的:对团队已构建的Lac-DOX/DOX纳米颗粒是否诱导ICD现象开展研宄,评价CRT迁移暴露、HMGB1蛋白释放、ATP释放等DAMPS的释放。方法:转录组测序分析Lac-DOX/DOX纳米颗粒与原药差异基因,GO聚类分析差异基因相关的细胞功能,利用流式细胞术检测CRT蛋白暴露于细胞膜表面的情况,荧光抗体标记HMGB1蛋白后使用共聚焦显微镜拍摄其释放情况,使用酶标仪和ATP检测试剂盒检测肿瘤细胞的ATP释放情况。结果:经过对经DOX和Lac-DOX/DOX处理后的Huh-7细胞转录组进行测序发现了9494个差异基因,GO功能聚类分析提示Lac-DOX/DOX纳米药物所引起的功能改变与细胞内质网应激有关。CRT细胞膜迁移率与阳性对照药物相同,HMGB1蛋白的红色荧光信号增多,已经从细胞核内部迀移至细胞质中,ATP释放显著增多。结论:综合以上CRT蛋白的暴露情况、ATP释放情况和HMGB1蛋白的释放情况三个指标结果,可以说明经过Lac-DOX/DOX纳米药物处理后,垂死的Huh-7会释放DAMPS进而诱导ICD的发生。有利于将DAMPs呈递给DC细胞,从而有望引发机体的抗肿瘤免疫,对这种现象的深度理解有助于化疗药物与免疫治疗结合得到优异的肝癌治疗效果。