目的:血管新生内膜的形成主要与血管内皮屏障受损,平滑肌细胞的异常增殖和迁移有关。miRNA-29a是miRNA-29家族中的一员,在体内表达丰富,几乎所有的细胞内均有表达。miRNA-29a参与肿瘤形成、细胞因子分泌、免疫炎症反应等多个过程。在心血管系统中miRNA-29a不但参与心肌纤维化,还与动脉粥样硬化的形成密切相关。但miRNA-29a在平滑肌细胞增殖方面的作用机制尚不清楚。通心络(TXL)是一种中药复方制剂,主要功效为益气活血,通络止痛。用于冠心病心绞痛属心气虚乏、血瘀络阻证者。通心络治疗心血管疾病已经取得了显著的疗效。但TXL作为一种中药,其发挥作用的机制复杂多样。本文主要进一步研究通心络抑制平滑肌细胞增殖和迁移的机制。方法:1小鼠被随机分为对照组,miR-29awt颈动脉结扎组,miR-29a+/+颈动脉结扎组,miR-29awt颈动脉结扎+通心络灌胃组,miR-29a+/+颈动脉结扎+通心络灌胃组。对颈总动脉进行苏木精一伊红染色观察血管内膜增生的形态学变化,免疫组织化学染色观察颈动脉增生内膜中PCNA的表达量。免疫荧光双重染色检测YY1和Cyclin D1在小鼠颈动脉血管壁中的表达。2体外培养人血管平滑肌细胞,分别转染miR-29a mimic和miR-29a inhibitor或给予通心络预孵育,Real time PCR检测miR-29a的表达水平,Western Blot检测PCNA,YY1和Cyclin D1表达水平。细胞迁移实验检测血管平滑肌细胞在过表达miR-29a后的迁移情况。结果:1 miR-29a在体内和体外均促进血管平滑肌细胞(VSMCs)的增殖和迁移小鼠随机分为三组:对照组、miR-29awt颈动脉结扎组、miR-29a+/+颈动脉结扎组。HE染色结果显示,miR-29a+/+小鼠组新生内膜增生更为明显,其I/M比值和内膜面积均明显高于miR-29awt小鼠组。免疫组织化学染色结果显示,miR-29a+/+小鼠组PCNA阳性颗粒明显高于其它两组。以上结果表明,miR-29a过表达促进颈动脉结扎诱导的内膜增生。体外培养的人血管平滑肌细胞(HVSMCs)分别转染miR-29a mimic(类似物)和miR-29a inhibitor(抑制剂)。Western Blot结果显示,过表达miR-29a后,PCNA蛋白表达量增高。敲低miR-29a后,PCNA蛋白表达明显降低。细胞划痕实验进一步发现,过表达miR-29a还可以促进平滑肌细胞的迁移。以上结果表明,在体外miR-29a促进VSMCs的增殖和迁移。2 miR-29a促进VSMCs的增殖的分子机制与下调YY1表达,促进Cyclin D1的表达有关免疫双荧光染色,与miR-29awt小鼠相比,miR-29a+/+小鼠中YY1表达降低,Cyclin D1表达升高。体外培养的HVSMCs,分别转染miR-29a mimic和miR-29a inhibitor。Western Blot结果显示,过表达miR-29a抑制YY1表达,促进Cyclin D1表达。以上结果提示miR-29a通过下调YY1,同时上调Cyclin D1的表达,促进平滑肌细胞的增殖。3通心络抑制颈动脉结扎诱导的内膜增生,并能逆转miR-29a对平滑肌细胞的促增殖作用。小鼠随机分为四组:miR-29awt颈动脉结扎组、miR-29awt颈动脉结扎+通心络组,miR-29a+/+颈动脉结扎组,miR-29a+/+颈动脉结扎+通心络组。HE染色结果显示,miR-29a+/+小鼠+通心络灌胃组与单纯miR-29a+/+小鼠结扎组相比,I/M比值和内膜面积均显著降低。免疫双荧光染色结果显示,miR-29a+/+小鼠+通心络灌胃组与单纯miR-29a+/+小鼠结扎组相比PCNA表达量显著下降。Western Blot结果与免疫荧光结果一致。体外培养的HVSMCs用通心络预孵育后,再过表达miR-29a。划痕实验结果显示,通心络可以抑制过表达miR-29a后平滑肌细胞的迁移。以上结果表明通心络在体内和体外均能抑制平滑肌细胞的增殖和迁移,并能逆转miR-29a对平滑肌细胞的促增殖和迁移作用。4通心络抑制平滑肌细胞的增殖的作用机制Real time PCR结果显示,通心络能显著降低miR-29a在血管平滑肌细胞的表达。免疫双荧光染色结果显示miR-29a+/+小鼠+通心络灌胃组YY1表达量明显高于单纯miR-29a+/+小鼠组。而Cyclin D1的表达与YY1正相反。Western Blot结果与免疫荧光结果一致。以上结果表明,通心络通过抑制miR-29a,从而上调YY1,抑制Cyclin D1的表达来实现其抑制平滑肌细胞增殖的作用。结论:1 miR-29a在体内和体外均促进血管平滑肌细胞(VSMCs)的增殖和迁移。2 miR-29a通过下调YY1,上调Cyclin D1的表达,促进平滑肌细胞的增殖。3通心络在体内和体外均能抑制平滑肌细胞的增殖和迁移,并能逆转miR-29a对平滑肌细胞的促增殖和迁移作用。4通心络通过抑制miR-29a,上调YY1,抑制Cyclin D1的表达来实现其抑制平滑肌细胞增殖的作用。