脲酶是催化尿素水解的专一性酶,在医学、食品、环境科学等领域具有广泛的应用。开发具有优良特性的脲酶是近年来脲酶的研究热点之一。目前报道的脲酶主要来自陆地植物或微生物,海洋脲酶可能具有不同于陆地脲酶的优势。本研究从中国南海海绵Siphonochalina sp.中筛选得到一株产脲酶海绵共生真菌Penicillium steckii S4-4,当培养基中添加的NiSO₄·6H₂O、尿素终浓度以及收菌时间分别为0.006%、0.4%、96 h时脲酶产量最高为21.5 U/mg菌丝体,以液氮研磨法联合超声波破碎法破碎细胞制备的粗提液比酶活达最大值25.12 U/mg蛋白。P.steckii S4-4脲酶粗提液经硫酸铵盐析、Hitrap DEAE阴离子交换层析以及Superdex 200凝胶过滤层析后,比活力提高了61.4倍至1542.2 U/mg,收率达到了17.54%。非变性PAGE特异性染色结果说明该真菌只产生一种大小的脲酶分子,结合SDS-PAGE以及全酶分子量标定结果表明该脲酶是亚基为47 kDa、总大小为183 kDa的α₄单亚基四聚体形式。Edman降解法测序显示其N-末端氨基酸序列组成为GPVLKKTKAAAV,与海洋藻类Ectocarpus siliculosus具有最大的同源性。酶学实验表明,该海洋真菌脲酶K_m与V_max值分别为7.3 mM、1.8 mM/min/mg,其最适温度、pH以及盐度分别为55℃、8.5、10%,且在25-60℃温度范围内保持30 min、pH 5.5-10.0或0-25%盐度梯度内保持6 h后活性都能维持稳定在80%以上。与陆地来源的刀豆脲酶相比,海洋P.steckii S4-4脲酶展现出更高的热稳定性、碱偏好性以及盐耐受性。分别采用海藻酸钠、聚乙烯醇以及明胶三种材料对P.steckii S4-4脲酶进行固定化,并对相应的固定化效果及酶学性质进行了比较,结果显示海藻酸钠-CaCl₂包埋效果最佳,其固定化率达61.47%,酶的最适温度从55℃提高至70℃,最适pH从8.5提升至9.5,在35-85℃保存半小时或在pH 7-10.5保持6 h后酶活仍能保持在90%以上,在4℃储存半衰期超过3个月,说明脲酶经固定化后具备更强的耐热性、耐碱性及储存稳定性。将该固定化脲酶装进φ2 cm×20 cm的柱子中于70℃下进行尿素废水处理,发现其处理流量达19 mL/min,对应的尿素降解率为90.25%,连续运转35 d效率不变,且固定化酶半衰期为65d,相应的尿素降解率能保持在50%。可见,固定化海洋脲酶进行尿素废水处理是一条潜在的有效途径。