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紫草宁是中药紫草根部合成的有效成分,具有多种药理学活性,包括抗肿瘤、抗炎、抗微生物、抗病毒、抗氧化、抗脂肪生成、免疫调节剂等。其中,紫草宁的抗肿瘤活性倍受关注。随着生活及工作压力的不断增大,环境的不断恶化,人们的健康水平也不容乐观,越来越多的人处于亚健康状态。由于人体免疫功能的下降,肿瘤患者随之增多。而目前真正抗肿瘤的有效药物不多,尤其对肿瘤晚期患者,特别是恶性肿瘤,几乎是束手无策。急待有确切疗效的抗肿瘤新药进入临床,给肿瘤患者带来福音。
本论文首先研究了紫草宁对体外培养的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)和多种肿瘤细胞的抑制作用;然后将紫草宁用脂质体包囊,研究了紫草宁脂质体的工艺和质量标准;接着研究了紫草宁及其脂质体对血管新生的抑制作用;最后对紫草宁及其脂质体抗血管新生的分子机理进行了研究和探索。主要研究结果总结如下:
体外细胞的抑制实验结果表明,紫草宁对乳腺癌MCF-7、MDA-MB-435细胞株,肝癌Heps、HepG2细胞株相对不敏感,对Hela细胞株作用中等敏感,而对A549和HUVEC细胞株则较为敏感。体内实验结果表明,紫草宁对体内腹水瘤和小鼠皮下实体瘤都有良好的抗肿瘤活性。但是紫草宁引起靶细胞膜破裂,基因组电泳条带呈现涂抹状,初步显示紫草宁对靶细胞的作用可能是坏死,这实际上是一种细胞毒害作用。
为了保持紫草宁对肿瘤的抑制作用同时又能减轻它的细胞毒害作用,我们采用了脂质体作为紫草宁的载体,将药物包囊在其中制备成紫草宁脂质体后和原料进行下面的对比研究。制备的紫草宁脂质体具有磷脂双分子层结构,颗粒大小在220nm以下,Zeta电位大于30,体系处于较稳定状态。由于脂质体易氧化变质,最后采用冻干保存。实验中还发现,紫草宁脂质体在荧光显微镜或共聚焦显微镜下能看到明亮的红色荧光,可用流式细胞仪进行荧光强度的测定,测定的结果和用传统的透析法测定的包封率结果是很接近的。但前者比后者操作方便,故可以优先选择用流式细胞仪测定包囊自身荧光药物脂质体的包封率。紫草宁脂质体与HUVEC作用一段时间后,在共聚焦显微镜下观察到紫草宁脂质体定位在靶细胞的细胞膜上,随着时间的推移,脂质体中的药物可能通过膜融合的通道,不断进入靶细胞质中,最后可以观察到靶细胞变红,充分证明药物从脂质体中释放进入靶细胞中。紫草宁脂质体通过尾静脉注射,可以在血浆中检测到红色荧光颗粒,所以紫草宁脂质体的自生荧光现象可以用于体内外药物的释放过程跟踪和细胞组织定位。
本论文建立了体内外各种血管新生模型,研究紫草宁及其脂质体对血管新生的作用。体外采用血管内皮细胞,因为新生血管主要是血管内皮细胞变形迁移等过程形成的。实验选用HUVEC细胞株进行研究,结果显示紫草宁及其脂质体能抑制HUVEC生长、迁移和微血管形成。体内采用鸡胚绒毛尿囊膜和小鼠体内基质胶栓模型,结果显示紫草宁及其脂质体抑制鸡胚绒毛尿囊膜和小鼠体内基质胶栓上的血管新生,基质胶栓的免疫组化结果进一步显示它们抑制血管新生标记蛋白CD31的表达。
为了研究紫草宁及其脂质体抑制血管新生进而抑制肿瘤的机理,我们先用计算机软件进行了分子模拟。模拟结果显示,紫草宁和人VEGF有良好的对接效应。接着研究了紫草宁及其脂质体对HUVEC细胞基因水平的调节。Q-PCR结果表明对VEGF、bFGF、EGF、TGF-β、mdr-1有下调作用;对IL-8、Il-1、TNF-α有上调作用,紫草宁脂质体较紫草宁的作用相对要弱些。最后,建立小鼠黑色素瘤肺转移模型。紫草宁及其脂质体用药一段时间后,能降低模型小鼠肺的湿重和黑色素瘤肺转移瘤灶的数目,这两个指标大小可以反应药物对黑色素瘤肺转移的抑制率。提取黑色素瘤肺转移肺的mRNA和蛋白,Q-PCR结果显示紫草宁及其脂质体抑制VEGF的基因水平;western blot结果显示对P-ERK有抑制作用。
紫草宁及其脂质体对体内外血管新生的作用和抑制血管新生机理的研究,得到一致的结论,紫草宁脂质体的抑制作用较同样剂量的紫草宁要缓和,说明紫草宁脂质体是一种细胞膜亲和性高、持续缓慢释放的优良剂型。
综合本论文实验的结果,绘制出紫草宁及其脂质体抑制肿瘤细胞分泌VEGF抑制血管新生的信号示意图,推测紫草宁及其脂质体可能是通过抑制VEGF-VEGFR-ERK信号途径传导来抑制血管新生。
通过抑制血管新生来抑制肿瘤生长是目前抗肿瘤的新方向,肿瘤组织生长过程中会出现血管新生的现象,血管新生给肿瘤细胞提供氧气和养料,同时排除二氧化碳和废物,肿瘤组织依赖血管新生营造的生存环境进行物质交换。故抑制血管新生可以有效地切断肿瘤组织的营养供应,从而“饿死”肿瘤细胞。
紫草宁及其脂质体抗血管新生和分子机制研究结果,为今后紫草宁进入临床提供技术保障;选择合适的制剂,让之顺利进入临床提供物质载体,故本研究课题无论从基础研究还是临床应用上,都具有深远的意义。