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目的:重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)是一种用于治疗临床缺血性脑卒中患者的重要药物,但近期研究发现,rt-PA通过诱导脑缺血后炎症反应破坏血脑屏障(BBB)。周细胞是神经血管单位(NVU)的重要组成成分,在维持BBB的完整性,调节血管生成、炎症和吞噬功能方面发挥着重要作用,目前尚未有相关报道关于rt-PA是否能通过影响周细胞来破坏血脑屏障。本文旨在研究rt-PA通过增加周细胞炎症反应来破坏BBB及其相关机制。方法:1.体外BBB模型构建:我们把小鼠微血管内皮细胞与小鼠微血管周细胞共培养构建体外BBB模型,通过测定共培养模型的电阻值变化确定共培养BBB模型成功。2.脑缺血再灌注模型构建:体内MCAO模型构建:将线栓通过左侧颈外动脉插到小鼠左侧大脑中动脉阻断血流1 h构建大脑中动脉闭塞缺血/再灌注模型。体外OGD/R模型:给予周细胞低氧低糖处理4h,4h后将细胞重新放在正常培养条件下再复氧12h或24h。3.BBB功能测定:体内模型,通过测定脑组织水肿情况,通过透射电镜观察血脑屏障超微结构,通过免疫荧光染色测定FITC-葡聚糖渗漏。体外共培养模型,通过测定体外共培养模型电阻、渗透率。4.小鼠脑血管周细胞增殖存活率测定:体内通过免疫荧光染色测定小鼠脑缺血/再灌注周细胞上Ki67表达。体外通过用MTT方法测周细胞存活率。5.周细胞炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α),单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的表达测定:体内通过免疫荧光染色测定小鼠脑组织周细胞上TNF-α,MCP-1的表达;体外通过实时荧光定量PCR测定周细胞上TNF-α,MCP-1信使RNA的表达水平,酶联免疫吸附试验测定周细胞上TNF-α,MCP-1的表达水平。6.信号通路蛋白血小板衍生生长因子受体-b(PDGFR-b)、转化生长因子-b(TGFb)、p-Smad2/3的表达水平测定:体内通过免疫荧光染色测定小鼠脑组织周细胞上PDGFR-b、TGF-b的表达;体外通过蛋白电泳测定脑血管周细胞上PDGFRb、TGF-b、p-Smad2/3蛋白的表达。7.PDGFR-b过表达周细胞模型构建:将构建的PDGFR-b过表达质粒转染至小鼠脑血管周细胞来构建PDGFR-b过表达模型,通过蛋白电泳测定PDGFR-b表达水平验证转染效率。结果:1.脑缺血后,给予rt-PA治疗增加了脑组织梗死侧水含量(P<0.05);透射电镜结果也显示给予rt-PA后脑组织梗死侧BBB的微观结构被进一步破坏。体外BBB模型给予低氧低糖处理后,再给予rt-PA处理好后体外BBB模型电阻降低,FITC-葡聚糖渗透率增加。2.免疫荧光及蛋白电泳结果显示脑缺血给予rt-PA治疗后降低了脑缺血后周细胞上PDGFR-b、TGF-b、p-Smad2/3的表达(P<0.05)。3.免疫荧光结果显示小鼠脑缺血后,给予rt-PA治疗后增加了周细胞TNF-α、MCP-1的表达(P<0.05),免疫荧光显示TGF-b联合rt-PA治疗减少了rt-PA引起的TNF-α、MCP-1炎症因子表达(P<0.05),Elisa结果显示给予rt-PA增加了低氧低糖处理后周细胞TNF-α、MCP-1炎症因子的分泌(P<0.05),而TGF-b联合rt-PA治疗减少了rt-PA引起的TNF-α、MCP-1炎症因子分泌(P<0.05)。4.免疫荧光结果显示依那西普(TNF-α抑制剂)联合rt-PA治疗减轻了小鼠脑缺血后rt-PA治疗引起的FITC-葡聚糖渗漏即BBB破坏。5.Elisa结果显示周细胞上PDGFR-b过表达降低了rt-PA干预后小鼠脑血管周细胞TNF-α、MCP-1的表达,但给予TPO427788 HCL后逆转了PDGFR-b过表达对TNF-α、MCP-1表达的影响6.体外共培养模型电阻,渗透率结果显示rt-PA治疗没有明显改变PDGFR-b过表达小鼠脑血管周细胞与小鼠微血管内皮细胞共培养模型低氧低糖处理后的电阻值和渗透率,但给予TPO427788 HCL后抵消了PDGFR-b过表达对BBB保护作用结论:本研究证实了rt-PA通过抑制PDGFR-b-TGF-b-p-Smad2/3通路增加脑缺血后周细胞TNF-α、MCP-1的表达来破坏BBB。这些研究结果表明,PDGFR-b-TGFb-p-Smad2/3通路可能为临床rt-PA治疗减轻BBB损伤提供新的治疗靶点,为rtPA联合治疗提供新的治疗药物。