前言:　　 脑缺血是世界上第三大使人致死致残的疾病，尽管对脑损伤的治疗主要致力于神经的保护作用，但目前急性脑缺血的治疗主要是通过给予血栓性溶解剂、组织型纤溶酶原激活物(t-PA)。然而，由于存在给药的时间窗问题，仅有1-2％的病人能够接受溶栓治疗。因此急需研究出新的治疗方案治疗此类疾病。　　 大量研究表明:啮齿类动物中短暂的全脑缺血损伤是由于短时间脑血流动力的丧失及海马神经元的氧糖剥夺导致的延迟性神经元死亡。活性氧（reactiveoxygen species，ROS）增多是促使脑缺血时神经元死亡的一个重要因素。过量的活性氧能够引发细胞结构的损伤并进一步损伤线粒体，最后导致细胞凋亡。　　 脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)和天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶-3（cystein-containing aspartate-specific protease-3，Caspase-3）是脑缺血疾病中的两个重要的影响因子，在局部性脑缺血所诱发的细胞凋亡过程中起到重要的作用。BDNF能够提高神经元的存活率和突触的可塑性，抑制短暂性脑缺血引发的细胞损伤、避免局部性脑缺血所产生的海马CA1区的神经元凋亡.Caspase-3是脑中含量最丰富的半胱氨天冬蛋白酶，是细胞凋亡的执行者。它能够激活依赖于半胱天冬酶活化的DNA酶，最终导致DNA链的断裂和细胞的丢失。这些研究证据表明BDNF和Caspase-3在脑缺血疾病的治疗中具有重要的作用。　　 癫痫是最普遍的神经系统疾病之一，神经元过度兴奋和氧化应激损伤已经被证实是癫痫产生的诱导因素。目前研究大多集中在与年龄有关的退行性疾病，其中包括癫痫的发作。已有报道称在癫痫的发生过程中氧自由基含量明显升高。同时，热休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)一种高度保守的分子伴侣，在蛋白质折叠中起着至关重要的位置。众所周知，HSP70是HSP家族中主要发挥作用的可诱导成分，能够避免蛋白的错误折叠，发挥强大的细胞保护作用。最新报道显示，过量的活性氧能够减少脑源性神经营养因子(brain-derived neurotropic factor，BDNF)在海马区的合成，并在调控神经元存活中发挥关键作用。研究表明，脑组织中BDNF的含量增加可以减少脑局部缺血时海马CA1区域的细胞损伤。　　 黄芩苷是从黄芩干燥的根部提取的一种中药，具有抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、抑制血栓形成和降低细胞凋亡的作用。同时，具有抗惊厥和抗焦虑作用。在中国已经广泛应用于治疗肝炎、哮喘等一些过敏性和炎性疾病。但迄今为止，黄芩苷是否对全脑缺血具有神经保护作用仍不清楚，另外，黄芩苷在TPMs癫痫发作时发挥的神经保护作用还未得到较好的解释。　　 本实验选用先天脑Willis环缺失的蒙古沙土鼠，阻断沙鼠两侧颈总动脉血流5分钟后血液复灌，制造全脑缺血模型。通过HE染色、抗氧化剂活性测定、BDNF和Caspase-3蛋白含量的变化检测等研究方法来评价黄芩苷在沙鼠全脑缺血再灌注损伤中的作用。应用自发癫痫鼠模型，通过测定TRMs癫痫发作的总次数、总时间、抗氧化剂的活性、HSP70、BDNF蛋白的表达等研究手段来评定黄芩苷的抗癫痫发作和神经保护作用。黄芩苷对全脑缺血再灌注损伤、癫痫发作的神经保护作用机制可能与其抗氧化作用有关。　　 实验方法:　　 一、脑缺血模型的建立　　 用10％的水合氯醛麻醉沙鼠(350 mg/kg)，暴露双侧颈总动脉，用动脉夹同时将双侧的颈总动脉夹闭，10分钟后打开，重新恢复血流，缝合皮肤，整个手术过程中沙鼠的体温保持在36-37℃，减少手术的死亡率。　　 二、HE染色实验　　 沙鼠麻醉后，心脏灌流，然后将脑组织放入4％多聚甲醛中固定24小时，30％的蔗糖沉糖4天，然后将脑组织切成6微米厚的脑片，参照试剂盒中的说明书对脑片进行HE染液，然后在光学显微镜下观察海马CA1区椎体细胞的变化情况。　　 三、EEG记录　　 以30mg/kg的戊巴比妥钠麻醉TRMs，根据Paxinos and Watson脑图集，在左额皮质（冠矢点向旁3.0mm，向嘴侧3.0mm）和左侧海马(冠矢点向尾侧4.0mm，向旁2.0mm，离皮质表面3.0mm)部位永久性植入一个不锈钢电极，将另一个参考电极埋入前额头骨。7天恢复期后，将每只大鼠放入40×40×40cm饿隔离箱观察其行为。经过30分钟适应后，用多导生理记录仪(BW-200，成都，泰盟)记录EEG。30分钟内，每5分钟对TRMs的脸部应用气压刺激，引起TRMs强直发作和维持警觉状态。当两个棘波时间间隔短于1s时，一个5-7Hz棘波持续超过1s被视作一次癫痫发作，观察30分钟内的发作总时间和总次数。　　 四、实时定量RT-PCR分析　　 提取海马总mRNA，参照试剂盒说明书进行实时定量RT-PCR。标准曲线法进行定量，检测海马Caspase-3 mRNA和BDNF mRNA表达。　　 五、检测超氧化物歧化酶，谷胱甘肽，谷胱甘肽过氧物酶和丙二醛的活性　　 海马组织匀浆后通过计算核苷酸氧化作用的抑制率检测超氧化物歧化酶的活性结果用U/mg蛋白定义。通过检测被H202氧化而减少的谷胱甘肽的氧化率来检测谷胱甘肽、谷胱甘肽过氧物酶的活性。用532nm的波长测量反应底物丙二酰硫脲来检测丙二醛的浓度，用丙二醛mg/蛋白代表丙二醛的量。蛋白的量以牛血清白蛋白为标准用考马斯亮蓝的方法检测。　　 六、免疫印迹分析　　 腹腔麻醉后快速取出鼠海马提取总蛋白。BCA法测蛋白浓度，上样后进行SDS-PAGE蛋白电泳，一抗(anti-HSP-70，1∶200稀释;anti-Caspase-3，1∶200稀释;anti-BDNF，1∶200稀释;β-actin，1∶5000稀释)孵育，二抗1∶5000稀释，ECL显影。实验结果用Quantity One软件分析。　　 七、统计学分析　　 各组结果以平均数±标准差表示，两组间比较用t检验，实验结果采用One-wayANOVA统计方法。　　 结果:　　 一、HE染色实验　　 缺血7天后HE染色检测沙鼠海马CA1区病理学的变化。假手术组的沙鼠未见各种病理学改变而那些手术造成缺血的模型组在海马的CA1区锥体细胞呈现出明显的损伤，和模型组比较，给予高剂量200mg/kg黄芩苷的给药组的受损神经元明显减少。100mg/kg和200mg/kg的黄芩苷组能够明显减少由暂时性缺血而引起的神经元损伤，而给予50mg/kg的黄芩苷却不能减少海马的损伤。　　 二、EEG测定　　 为了评估黄芩苷对TRM抗癫痫发作的影响，我们首先完成了EEG。在30分钟记录时间内，TRM组癫痫发作的总时间(p＜0.01)和总次数(p＜0.01)有明显增加。然而，在100 mg/kg(p＜0.01)和200 mg/kg(p＜0.01)黄芩苷治疗组中这个现象被有效地抑制。与TPM组比较，50 mg/kg黄芩苷治疗组却没有观察到明显差异。　　 三、实时定量RT-PCR　　 通过实时定量PCR检测与细胞凋亡相关的两个重要因子BDNF和Caspase-3的mRNA表达，来探究黄芩苷是否对沙鼠脑缺血的神经元损伤具有保护作用。沙鼠脑缺血组海马中BDNF的mRNA表达从0.82±0.11(p＜0.01，n=6)降为0.62±0.06(p＜0.01，n=6)，而后分别给予100、200mg/kg的黄芩苷后会使BDNF表达分别从0.62±0.06增加到0.76±0.09(p＜0.01，n=6)和从0.62±0.06到0.90±0.06(p＜0.01，n=6).Caspase-3的mRNA表达同假手术组比较增加0.36±0.02(p＜0.01，n=6)到0.69±0.05(p＜0.01，n=6）。然而分别给予100、200mg/kg的黄芩苷组同缺血组比较Caspase-3的表达分别从0.69±0.05降为0.63±0.04(p＜0.01，n=6)和从0.69±0.05变化为0.56±0.02(p＜0.01，n=6）。　　 四、检测超氧化物歧化酶，谷胱甘肽，谷胱甘肽过氧物酶和丙二醛的活性　　 全脑缺血5分钟的沙鼠造模7天后，丙二醛的含量在给与生理盐水组同假手术组比较显著增加，从3.28±0.40增加到5.16±0.79 nmol/mg蛋白(p＜0.01，n=6）。分别给予黄芩苷后依据剂量不同(50、100、200 mg/kg)同给与生理盐水组比较分别减少到4.20±0.49nmol/mg(p＜0.05，n=6)，4.02±0.53nmol/mg(p＜0.05，n=6)和3.59±0.70 nmol/mg蛋白(P＜0.01，n=6)。抗氧化剂的活性和氧化还原酶的指数。沙鼠脑缺血海马组织中超氧化物歧化酶的活性与假手术组比较显著降低从114.37±13.70较少到86.97±10.03 U/mg(p＜0.01，n=6)。然而给予200mg/kg的黄芩苷组同给予生理盐水组比较氧化物歧化酶的活性从86.97±10.03增高到111.70±13.33U/mg(p＜0.01，n=6)。另外同假手术组与沙鼠两侧颈总动脉闭塞5分钟后的7天每天给予生理盐水组比较，还原型谷胱甘肽的量从52.07±10.28减少到2.55±5.44(p＜0.01，n=6)，谷胱甘肽过氧物酶的活性从54.19±6.47减为30.37±5.34U/mg(p＜0.01，n=6）。同缺血组比较，给予200mg/kg的黄芩苷组，还原型谷胱甘肽的量从22.55±5.44增加到43.55±5.82(p＜0.01，n=6）同时谷胱甘肽过氧物酶的活性从30.37±5.34增加到50.09±6.55U/mg(p＜0.01，n=6)。同时给予100mg/kg的黄芩苷组同给予生理盐水组谷胱甘肽过氧物酶的活性显著增加30.37±5.34到40.07±7.14U/mg(p＜0.05，n=6)。注射生理盐水或黄芩苷7天后，我们发现生理盐水治疗TRMs组海马中的MDA水平、脂质过氧化作用指数明显增高(p＜0.01)，与之相比较，对照组和黄芩苷治疗TRMs组中的MDA水平(B50∶p＜0.05; B100:p＜0.01;B200:p＜0.01)有明显降低。此外，测量了海马匀浆中的抗氧化酶和抗氧化剂活性。值得注意的是，与对照组相比，TRMs组海马中的SOD活性明显降低。然而，与生理盐水组相比，200 mg/kg黄芩苷治疗组可以引起SOD活性增强(p＜0.01)。并且，与野生型组相比较，TRMs海马中的GSH-PX(p＜0.01)和GSH(p＜0.01)明显减少。与TRMs组相比较，200 mg/kg黄芩苷治疗组可以明显增强海马中GSH-PX活性(P＜0.01)和GSH数量(p＜0.01)。同时，与生理盐水治疗组相比较，100 mg/kg黄芩苷治疗组的GSH-PX活性有惊人的提高(p＜0.05)。　　 五、免疫印迹　　 BDNF在脑缺血沙鼠海马中的蛋白表达与对照组比较显著降低1.22±0.09到0.74±0.09。然而给予不同剂量的黄芩苷(50，100，200mg/kg)后BDNF的表达与缺血组比较明显升高0.94±0.05(p＜0.01,n=6)，0.95±0.07(p＜0.01，n=6)和1.15±0.06(p＜0.01，n=6)。免疫蛋白印迹Caspase-3抗体显示的位置17、20kDa.Caspase-3在脑缺血沙鼠与对照组比较增加0.52±0.05到1.51±0.09(p＜0.01，n=6)。给予50mg/kg的黄芩苷Caspase-3的蛋白表达未见改变1.51±0.09 to1.45±0.11(p＞0.05，n=6）。然而给予100和200 mg/kg的黄芩苷与给以生理盐水组比较Caspase-3明显降低1.51±0.09到0.76±0.11(p＜0.01，n=6）和1.51±0.09到0.64±0.05。HSP70特异性抗体的表达结果。与对照组相比，TRMs海马的HSP70蛋白表达明显减少(p＜0.01)。然而，与TRM组相比，100 mg/kg和200 mg/kg黄芩苷治疗组的HSP70明显增加(B100: p＜0.05; B200: p＜0.01)。与对照组相比，TRMs的BDNF蛋白水平有明显的减少（p＜0.01），50mg/kg黄芩苷治疗组似乎没有改变(p＞0.05)。与生理盐水治疗组相比，100mg/kg和200mg/kg黄芩苷治疗组的BDNF蛋白表达明显增加(p＜0.05)。　　 结论:　　 1、本实验首次证明，黄芩苷能够减少沙鼠全脑缺血再灌注损伤后的MDA含量、增加SOD、GSH-Px、GSH活性，从而起到抗氧化的作用。　　 2、本实验首次证明，黄芩苷通过增加BDNF含量、减少Caspase-3含量和降低Caspase-3活性来减轻全脑缺血再灌注损伤。　　 3、通过EEG测定，首次证实了黄芩苷预处理TRMs显著减少癫痫发作总次数和总时间。　　 4、首次证实了黄芩苷能够明显抑制了TRMs海马区MDA含量，同时使SOD、GSH-Px、GSH的活性明显增加。　　 5、首次证实了黄芩苷治疗TRMs癫痫发作，可以引起HSP70和BDNF蛋白水平明显增加。说明黄芩苷具有抗TRMs癫痫发作的神经保护作用。