基于适配体功能化金属纳米簇新型荧光探针的真菌毒素特异灵敏检测方法研究

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食品安全问题是全球首要的公共卫生问题。真菌毒素的存在给食品安全带来了巨大挑战。真菌毒素是一组结构多样的真菌次级代谢产物,可产生刺激机体毒理学作用,痕量的食源性真菌毒素就足以改变机体正常的免疫功能。在农业、药理学、免疫学、环境、医学等领域,与真菌毒素有关的研究已取得了巨大进展,并已建立多种用于测定真菌毒素的常规方法。然而常规和免疫学方法存在明显不足与局限,因此迫切需要开发新型、快速、灵敏和稳定的方法用于检测真菌毒素。近年来,随着适配体功能化的金属纳米簇材料(Metal nanoclusters,MNCs)在生物传感和生物成像领域的应用潜力被不断发掘,发光适配体传感器开始被用于真菌毒素的定量检测。MNC粒径小、合成简便、易于适配体功能化,具备优异的生物相容性和光稳定性,并能有效地将能量转移至其他荧光团和淬灭剂,因此MNCs在荧光传感分析方法中具有广阔的应用前景。在本研究中,合成并表征了几种MNCs,随后将适配体功能化的MNCs与多种纳米材料,如AuNPs,MoS2和WS2纳米片复合使用,构建了一系列灵敏、简单、高效和快速的真菌毒素检测方法。首先,基于荧光能量共振转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)机理制备了一种适配体-AgNCs荧光探针用于检测T-2毒素。将适配体-AgNCs荧光探针用作能量供体,其荧光被荧光受体MoS2淬灭,T-2毒素的加入使得适配体-AgNCs从MoS2表面解离,荧光恢复值与T-2毒素的浓度有关。检测的线性范围是0.005~500 ng m L-1,检测限为0.93 pg mL-1。实际样品加标回收实验表明所建立的检测方法具有良好的特异性和灵敏性,在小麦和玉米样品中的回收率分别为90.41%~107.75%和89.46%~102.08%。同时使用商用ELISA试剂盒对该检测结果进行了交叉验证。以上结果表明所建立的方法在T-2毒素的风险测定中具有一定的实用性。其次,再度使用AuNCs开发了一种简单、快速、灵敏的方法用于T-2毒素的定量以及可视化检测,该方法检测限较所建立的第一种方法更低。通过自组装纳米技术,制备了一种高发绿光的Arg@ATT-AuNCs纳米材料,为防止PDDA诱导AuNCs聚集产生荧光信号进而影响定量结果,用PAA封闭Arg@ATT-AuNCs外壳构建了PAA@Arg@ATT-AuNCs纳米材料。基于可溶性PAA@Arg@ATT-AuNCs纳米材料和PDDA-聚集-AuNPs,实现了T-2毒素的荧光和可视化检测。分散的AuNPs可以淬灭PAA@Arg@ATT-AuNCs纳米材料的荧光,但PDDA聚集的AuNPs对荧光的影响很小。适配体与PDDA间的静电相互作用可阻止AuNPs的聚集(520 nm处吸光度),同时分散的AuNPs基于FRET机理淬灭了PAA@Arg@ATT-AuNCs纳米材料的荧光(530 nm处发射)。向体系中加入T-2毒素后其与适配体形成复合物,随后PDDA的存在使失去了适配体保护的AuNPs发生聚集(吸光度665nm),从而使PAA@Arg@ATT-AuNCs纳米材料的荧光恢复。这种无标记的荧光和比色法可用于灵敏地定量检测T-2毒素,检测限低至0.57 pg m L-1(线性范围0.001~100 ng mL-1),且在其它干扰物质存在下仍可实现T-2毒素的选择性检测。本研究所建立完善的合成新型核-壳纳米材料的方法,可推广应用到环境和农业样品的现场检测。第三,不同真菌毒素的联合毒性效应对人类和动物健康进一步构成威胁。因此,有必要建立一种诊断方法同时识别多种毒素。本论文首次使用双色Au NCs(Lp-AuNCs和BSA-AuNCs)以及WS2纳米片构建了由适配体介导的“turn on”FRET生物传感器,在单一波长激发(370 nm)下同时检测黄曲霉毒素B1(AFB1)和玉米赤霉烯酮(ZEN)。其中,将AFB1-apt-Lp-AuNCs(442 nm)和ZEN-apt-BSA-AuNCs(650 nm)用作能量供体,将WS2纳米片用作荧光淬灭剂。加入AFB1和ZEN后,通过监测442 nm和650 nm处的荧光值变化可以实现对两种毒素的同时检测,检测限分别为0.34 pg m L-1(R2=0.9931)和0.53 pg mL-1(R2=0.9934)。此外还可以通过图像实现对AFB1和ZEN的可视化半定量检测。构建的方法与ELISA的结果保持一致,可以应用于环境和农业污染物的检测。与传统的荧光检测法相比,适配体功能化的MNCs为荧光生物检测提供了新的思路。所构建的适配体功能化MNCs与其他纳米材料的复合物已被应用于实际食品样品检测。本研究工作为真菌毒素的识别和检测提供了一种全新的解决思路,同时为开发经济、灵敏、方便且具选择性的MNCs荧光“switch-on”探针开辟了一条新途径,并有望在多功能生物传感中应用。
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