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伪狂犬病是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起牲畜以发热、瘙痒、脑脊髓炎为主要特征的一种传染病,又被称为Aujesky病。猪伪狂犬病临床上主要表现为发病猪体温升高,育肥猪主要是呼吸困难,母猪常发生流产,对养猪业危害极大。自2011年以来,中国北方等多地免疫过Bartha-K61疫苗的猪场出现猪伪狂犬病疫情,之后疫情逐步向全国大部分养猪场蔓延。经初步研究,该毒株的致病性有所增强,是一种伪狂犬病毒的变异毒株,而PRV Bartha-K61对伪狂犬变异毒株不能提供完全保护力。因此研制出一种新的针对伪狂犬病毒变异株的疫苗对我国养猪业是当务之急。本文从江苏、安徽的BarthaK61株免疫猪场采集发病死亡猪的脑组织,分离获得三株病毒,即AH02LA株、LH08株和PRV V+株。应用PRV糖蛋白E基因(gE)的特异性引物通过PCR扩增gE片段,证明分离株均为PRV野毒,为研究变异株的基因变化与抗原性和毒力变化的情况,我们通过PCR扩增并测定了 AH02LA株、LH08株和PRV V+株的11个主要的囊膜蛋白的基因,并将其与PRV经典株(Bartha、Kaplan、Becker)和TJ变异株的糖蛋白基因作序列对比和遗传演化分析。结果发现,三个株分离株之间的差异极小,同源性达99.9%以上,但这些糖蛋白与经典株的变异较大,发生了较多的非同义替代,且gB、gC、gD、gE发生了显著了插入或缺失。其中,AH02LA的gB基因与Becker(JF797219)经典株的gB基因相比在350-361之间插入了 12个碱基,与Bartha(JF797217)与Kaplan(JF797218)gB基因相比在227-234之间缺失了 9个碱基,差异显著。gC、gD、gE基因与2014年新分离的TJ变异株的同源性为100%,gC基因与Bartha、Kaplan、Becker株的相比在174-194之间插入了连续的21个碱基,gD基因与Bartha和Kaplan株的相比在825-830间连续插入了 6个碱基,gE基因与Kaplan和Becker株的相比在142-144和1481-1483各插入3个碱基。人工发病试验表明,用2mL的AH02LA病毒(106/0.1mL)滴鼻接种60～65日龄的PRV抗体阴性猪,致死率可达100%。这证明了 AH02LA株、LH08株、PRV V+株均为PRV新型变异野毒株,其应是来源于同一个发生了显著变异的野毒株,这为猪伪狂犬病的流行病学监测和新型疫苗的研制提供依据。进一步以PRV AH02LA株为亲本株,以同源重组的方式,将gE、gI基因全部序列替换成细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome,BAC)载体mini-F功能序列,构建成PRV-AH02LA(AgE/gI)-pHA2双基因缺失株,转化感受态细胞后获得PRV AH02LA株的BAC(PRV BAC-11),对其进行PCR和RFLP验证,结果显示该BAC完全缺失了 gI和gE基因。用PRV AH02LA BAC基因组DNA转染经Cre酶处理后的CEF细胞进行loxp-Cre重组,在紫外光激发下观察到未出绿色荧光的白斑,成功拯救了无mini-F的PRV AH02LA的gE、gI双基因缺失重组病毒株,命名为PRV-AH02LA(AgE/gI)。为了构建恢复株,用PRV-AH02LA的DNA为模板,用引物PRV H1F、PRV H2R进行PCR扩增,片段与PRV BAC-11质粒DNA共转染重组,在紫外光激发下观察到未发绿色荧光的白斑,成功拯救了重组病毒,命名为PRV-AH02LARec。从病毒的体外生长曲线可以看出,基因缺失株PRV-AH02LA(AgE/gI)和恢复株PRV AH02LARec与亲本株AH02LA具有相似的生长动力学。在感染细胞后基因缺失株PRV-AH02LA(AgE/gI)和恢复株PRV AH02LARec的增殖速度相比亲本株较慢,并且病毒滴度也略低于亲本株。本研究还对该基因缺失病毒PRV-AH02LA(AgE/gI)进行了安全性和免疫原性评价。将PPV-AH02LA(△gE/gI)分别以105TCID50、104TCID50、103TCID50剂量接种猪后,免疫猪未出现任何PR临床症状,免疫后7天用强毒株PRV(107.5TCID50/mL)攻毒后,攻毒期间所有的免疫猪无任何临床症状,未检出排毒,均得到了完全的保护力。而Bartha-K61弱毒苗组在攻毒后体温升高并检出排毒。这表明该基因缺失病毒PRV-AH02LA(AgE/gI)对猪安全,具有良好的免疫原性,能够保护猪抵御强毒的攻击,是一种较好的备选疫苗株。