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研究目的:脊索瘤是一种起源于胚胎残余脊索的恶性骨源性肿瘤,据国外数据统计其发病率占原发性恶性骨肿瘤的1%-4%;而本课题组统计的华东区地区骨肿瘤发病数据显示其占比高达9.8%,是最常见的恶性骨源性肿瘤。脊索瘤对化疗不敏感,对放疗部分敏感,目前手术切除是治疗脊索瘤的主要手段。尽管脊索瘤恶性程度较低,但“手术-复发”的循环在患者生存期内几乎无法避免,由于术后解剖结构的紊乱,以及毗邻重要神经血管,每次复发都会加大手术难度,肿瘤最终无法得到有效控制,导致患者死亡。因此,研究脊索瘤恶性生物学行为的分子机制,是探索脊索瘤新的治疗策略及靶向药物的关键。我们通过转录组测序发现碳酸酐酶3(CA3)和NeuroD1在脊索瘤组织中的表达显著高于正常脊索组织。CA3是碳酸酐酶基因家族中的一员,在体内主要参与氧化代谢和离子交换有关的关键生理过程;Neuro1是一种胚胎发育过程中高表达的转录因子。两者在脊索瘤中尚无报道,本课题拟阐明Neuro1对CA3是否具有转录调控关系及其对脊索瘤恶性生物学的作用。实验方法:1、通过蛋白免疫印迹实验、病理学标本处理以及组织芯片高通量免疫组化染色,验证CA3和NeuroD1在脊索瘤组织中和细胞中的表达情况以及共表达关系。2、通过信息学挖掘、基因片段PCR合成、琼脂糖凝胶的电泳与回收、质粒克隆重组等分子生物学技术构建目标基因的过表达载体及荧光素酶报告载体,通过双荧光素酶报告实验检测NeuroD1是否对CA3具有转录激活作用。3、构建NeuroD1和CA3的敲减与过表达脊索瘤细胞系,通过WB实验检测表达或敲减效率,CCK8和Transwell实验检测干预CA3或NeuroD1表达后脊索瘤细胞的增殖及侵袭能力。将CA3敲减脊索瘤细胞进行转录组测序和分析,挖掘存在关联的肿瘤相关基因和信号通路。实验结果:1、选取5名脊索瘤患者的肿瘤组织标本和正常椎间盘组织作为对照进行蛋白质免疫印迹实验,发现CA3和NeuroD1在脊索瘤组织中的表达量高于正常组织。在后续的组织芯片免疫组织化学染色中再次确认了CA3和NeuroD1在脊索瘤细胞中异常表达升高。初步证明了两者在脊索瘤组织中高表达且存在共表达关系。2、通过生物信息学预测了NeuroD1在CA3启动子区域的结合位点,以此设计出共价结合的目标片段,构建了两者的过表达荧光素酶报告基因载体,并通过双荧光素报告基因验证证明了NeuroD1与CA3基因具有靶向调节关系。3、通过CCK8增殖和Transwell实验证实过表达CA3可以显著促进脊索瘤细胞的增殖及侵袭能力;相反,敲减CA3的表达可以显著抑制脊索瘤细胞的增殖及侵袭能力。同时,敲减NeuroD1的可以导致CA3表达量的减低,进一步证实NeuroD1对CA3存在调控作用。通过敲减CA3的脊索瘤细胞的转录组测序分析,发现了171个差异表达基因和6条存在明显富集的信号通路。实验结论:1、发现NeuroD1和CA3在脊索瘤组织中相比正常组织表达量升高,且存在共表达关系;2、构建了CA3和NeuroD1的过表达载体,从分子和蛋白功能层面首次证明了NeuroD1对CA3基因存在转录激活作用;3、CA3基因对脊索瘤细胞的增殖与侵袭起促进作用,在脊索瘤的促癌基因。CA3基因功能受抑制后,有171个基因出现显著的表达改变,并富集于6条信号通路中,其中的调控机制仍需进一步研究。