番茄溃疡病(Bacterial canker of tomato)是番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)生产中最为严重的病害之一,病原菌为密执安棒状杆菌密执安亚种(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Cmm)。该病自从1909年首次在美国密执安州的温室番茄上发现以来,发生频繁,现已广泛分布于世界各番茄产区。近年来在我国的发生呈上升趋势,被列入我国检疫对象的名单。Cmm可随带病种子、病苗、病残体及土壤传播,形成初侵染,国内外尚无防治该病的有效方法。已报道的一些措施仅局限在一定程度上控制病害的发生和蔓延。因此建立灵敏可靠的检测措施和开发有效的防治方法对于控制该病害的发生和发展有重要的意义。本研究建立了以寄主为内参的番茄溃疡病菌多重PCR检测方法,并从生物防治的角度出发对番茄溃疡病菌拮抗菌株西唐链霉菌Z-L-22进行了研究。1.针对PCR检测中可能出现的假阴性结果,建立了以番茄DNA为内参,检测番茄植株和种子中番茄溃疡病菌的多元PCR反应体系。反应体系中加入针对番茄溃疡病菌ITS基因区域特异性引物PSA-4/PSA-R和针对番茄17S rRNA的特异性引物NS-7-F/NS-8-R,以及病菌和番茄DNA进行扩增。在特异、灵敏检测病原菌扩增的同时还增加了基于番茄基因保守区域进行的内参反应来检测扩增结果的可靠性。采用该引物组合可从病菌和番茄混合DNA中扩增出相应的目的条带。优化了两引物加入的比例、浓度、扩增的退火温度,优化后的反应体系检测灵敏度可达5×102 cfu/mL。应用该体系可以在针刺法接种后6 d未显症植株和5×104 cfu/mL菌悬液浸泡的种子人工模拟带菌种子中检测到病原菌,有效地减少扩增中的假阴性结果。2.在温室条件下对本实验室保存的番茄溃疡病菌拮抗菌西唐链霉菌Z-L-22对番茄溃疡病的防治效果进行了研究。采用土壤混入病原菌接种的方法,对西唐链霉菌Z-L-22及其代谢产物采取了活菌拌种、发酵滤液浸种和土壤中接入拮抗菌3方法进行施药。结果发现,活菌拌种效果最好,其次是土壤中接入拮抗菌,最后是发酵滤液浸种,防效分别为70.5%、67.9%和43.2%。该结果为利用该菌株进行田间防治番茄溃疡病提供了依据。3.对于番茄溃疡病菌拮抗菌株西唐链霉菌(Streptomyces setonii)Z-L-22进行了活性物质研究。使用薄层层析(展层剂为苯:乙酸乙酯:甲醇=19:19:4)对发酵液萃取物进行分离,对分离的Rf值为0.64和0.56两个主要活性成分回收。采用Doskochilova八溶剂系统纸层析方法,得到这两种成分在不同溶剂中的Rf值,与标准谱图对比,确定这两种物质都为放线菌素类抗生素。利用放线菌素类抗生素合成酶保守引物在该菌基因组中扩增到770 bp的相关基因片段(基因登录号为:FJ767838),序列分析结果显示与金羊毛链霉菌(Streptomyces chrysomallus)放线菌素合成酶III (actinomycin synthetase III, acmC)基因(基因登录号为: AF204401.1)有82%的相似性。表明该菌株中含有放线菌素合成酶相关基因,进一步证实了该菌产生抗生素的类别,也为在基因水平上研究该菌的抗生素合成奠定了基础。4.使用染色体步移技术对西唐链霉菌Z-L-22基因组中已得到的770 bp放线菌素合成相关片段进行延伸。试验中改进了染色体步移的方法,命名为非特异性锚定引物PCR方法(Nonspecific Primer Anchored PCR,NPA-PCR)。从已知序列设计基因特异性嵌套引物,用含有简并碱基的长随机引物为非特异锚定引物,通过调节退火温度来控制引物与模板的复性,使随机引物非特异性的与模板结合,起到目的序列端锚定的作用,以实现对目的区域的扩增;而非特异扩增序列由于两端都结合有同样的随机引物,在退火时形成锅饼结构抑止了扩增。应用NPA-PCR方法对已得到的基因片段进行染色体步移,在已有片段上游和下游分别延伸了1474 bp和701 bp,在NCBI Blastn上比对,延伸片断与原有片断在同一基因簇中比邻,为目的扩增,证明了该方法的可行性。把得到的5’端延伸序列、3’端延伸序列及原序列拼接后得到2716bp的基因片段,在GenBank上比对,与Streptomyces chrysomallus放线菌素合成酶III基因(acmC)有79%相似性。5.用NCBI上的Flameplot软件分析克隆到的西唐链霉菌Z-L-22中2716 bp放线菌素合成相关片段,有一个1683 bp的开放阅读框,命名为ssaX(Streptomyces setonii actionmycin gene X),对预测蛋白结构域分析,发现该蛋白表现肽合成酶的特性。片段中部位置插入1000 bp的卡那抗性基因片段基因与温敏型质粒pKC1139连接组成基因破坏载体进行功能验证。结果发现,该基因的破坏导致西唐链霉菌Z-L-22对番茄溃疡病菌的抑制能力下降,TLC分析表明ssaX阻断突变株代谢产物发生变化,说明该基因对于放线菌素的正常合成是必须的。