研究背景:肺癌是目前全世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一。近二十年来,分子靶向药物的应用逐渐增多,己经成为具有表皮生长因子受体(EGFR)敏感基因突变的晚期非小细胞肺癌(NSCLC)的一线治疗选择。EGFR是NSCLC常见的癌症驱动基因,EGFR敏感基因突变阳性是应用酪氨酸激酶抑制剂(TKI)靶向药物的前提。虽然EGFR基因敏感突变的晚期肺癌患者接受EGFR-TKIs治疗的有效率可达到60%-80%,但大多数患者最终都会不可避免地出现T790M、C797S等EGFR耐药基因突变,目前EGFR检测主要依靠组织活检标本,液体活检对肺癌靶向治疗的指导作用,越来越受到关注。液体活检主要包括循环肿瘤脱氧核糖核酸(ctDNA)和循环肿瘤细胞(CTCs)的检测。CTCs是由原发或转移病灶脱落进入外周血的肿瘤细胞,其作为一种实时“液体活检”的材料反映了肿瘤是否发生侵袭转移,CTCs在肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤的诊断初期均能检测到,是疾病不良预后的独立预测因素。利用ctDNA进行EGFR突变分析的技术正在逐步进入临床,CTCs也具有即时性、可富集性,且携带较ctDNA更为完整的肿瘤分子生物学信息,具有潜在更高的分子生物学检测敏感性。为此临床上基于CTCs的EGFR突变检测及潜在的异质性分析,具有重要耐药机理和临床靶向治疗的研究价值。研究目的:本研究的目的是通过建立CTCs检测、分离的技术平台,检测并分离临床肺癌患者外周血CTCs,进行DNA提取扩增、EGFR突变的分析,并探索外周血CTCs的异质性。研究方法:单个循环肿瘤细胞分离技术的建立。本研究将肺癌细胞系掺入全血,去除红细胞,运用全自动磁性细胞分选仪分选掺入的细胞,阳性组分进行细胞固定,上皮标识免疫荧光抗体进行细胞染色,CellEctor进行计数及分离细胞。临床肺癌患者循环肿瘤细胞的临床检测。共入组121例肺癌患者、20例肺部良性疾病患者和20例健康志愿者(对照组),收集外周血标本(4.5 mL)。通过用抗细胞角蛋白/抗EpCAM/抗CD45抗体和hoechst染色进行免疫细胞化学检测,利用CellEctor进行CTCs计数,并捕获分离单个CTC。肺癌患者循环肿瘤细胞的EGFR突变分析。分离CTCs后进行核酸提取、扩增。使用扩增阻滞突变系统(ARMS)和数字聚合酶链式反应(dPCR)等技术分析EGFR基因突变,及CTCs信息分析。研究结果:在肺癌细胞系掺入外周血的回收实验中,选择NCI-H2009作为掺入首选细胞,裂解红细胞,CD326磁珠阳性分选细胞,运用丙酮进行细胞固定,双上皮标识的免疫荧光抗体进行细胞染色,CellEctor进行细胞计数、挑选分离。掺入细胞数分为2、5、10、20、40、100共5个梯度,掺入实验前后共重复4次。掺入2个细胞的时候,回收率在50%-100%(平均62.5%);掺入10个细胞的时候,回收率在60%-80%(平均67.5%);掺入100个细胞的时候,回收率趋于稳定在83%-89%(平均84%),掺入实验的总体回收率在62.5%-84%之间。确诊为肺癌的109例患者,其整体检出率57/109(54.8%)。TNM分期IIIIV期肺癌患者CTC总体捕获率为61.5%(56/91),而在健康志愿者中未检测到CTC。III期和IV期患者的CTC阳性检出率分别为25.0%(4/16)和69.3%(52/75),结果具有统计学意义(Mann-Whitney检验,P=0.0081)。小细胞肺癌患者的CTC检出数量(平均8.22)明显高于其他病理类型的患者,肿瘤长径与CTCs计数结果不具有统计学意义。在EGFR突变阳性的患者中,单个CTC水平EGFR突变检出率较低(16.67%,2/12)。灵敏度随着CTC数量的增加而增加。4例患者在10个细胞水平显示与组织突变一致的EGFR突变,1例患者在CTC之间显示明显不一致和罕见的突变(G719X)。结论:建立了用于从血液中分离CTC的简化技术,多个CTCs分析可提高EGFR突变检测敏感性;CTC和组织标本中EGFR突变的检测通常表现出同质性,而CTC水平突变分析可能有助于发现异质性突变,具有深入研究价值。