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第一部分Na HS对N2a细胞线粒体分裂融合的影响及机制研究目的:1.检测外源性硫化氢供体硫氢化钠(Na HS)对小鼠脑神经瘤细胞(N2a)细胞线粒体分裂融合的影响。2.检测不同浓度Na HS对N2a细胞活力及线粒体能量代谢的影响。3.检测Na HS对N2a细胞线粒体动力相关蛋白(Drp1)蛋白及m RNA表达的影响。4.检测ERK1/2通路在Na HS对Drp1表达影响中的作用。方法:1.用透射电镜检测不同浓度,不同时间的Na HS处理N2a细胞后线粒体形态学变化。2.MTT法测定不同浓度Na HS处理后N2a细胞活力变化。3.ATP检测试剂盒测定不同浓度Na HS处理后N2a细胞线粒体ATP产量变化。4.Western blot,QRT-PCR检测不同浓度Na HS处理后N2a细胞Drp1 m RNA及蛋白表达水平变化。5.采用慢病毒过表达Drp1后,电镜检测Na HS处理的N2a细胞线粒体形态学变化。6.采用ERK1/2通路抑制剂及Na HS处理N2a细胞,采用Western blot检测ERK1/2的磷酸化水平,Drp1蛋白表达水平变化。结果:1.同对照组相比,100,200,400μM Na HS处理后单个细胞线粒体数目逐渐减少,伸长线粒体比例逐渐增多。其中200,400μM Na HS处理组变化最明显(P<0.01),与对照组相比,400μM Na HS处理N2a细胞8h,16h之后线粒体数目均显著减少,伸长线粒体比例均显著增多,其中16h组变化最明显(P<0.01)。2.同对照组相比,Na HS处理组N2a细胞活力逐渐提高,其中400,600μM Na HS组与对照组相比均有明显差异(P<0.05)。3.同对照组相比,Na HS处理组N2a细胞线粒体ATP产量逐渐增加,其中400,600μM Na HS组与对照组相比均有明显差异(P<0.05)。4.同对照组相比,Na HS处理组N2a细胞Drp1蛋白表达水平逐渐降低,其中200,400μM Na HS组明显降低(P<0.05)。与对照组相比,Na HS处理组N2a细胞Drp1m RNA表达水平逐渐降低,其中400μM Na HS组Drp1m RNA表达明显降低(P<0.01)。5.同与对照组相比,Drp1过表达慢病毒感染N2a细胞后,其蛋白表达明显升高(P<0.01)。与对照组相比,400μM Na HS组线粒体的数目均明显减少(P<0.01),伸长线粒体比例均明显增多(P<0.01)。与400μM Na HS组相比,400μM Na HS+LV-Drp1组线粒体数目均明显增多(P<0.01),伸长线粒体比例均明显减少(P<0.01)。6.同对照组相比,400μM Na HS组ERK1/2磷酸化水平明显升高(P<0.01),与400μM Na HS组相比,400μM Na HS+50μM PD98059组ERK1/2磷酸化水平明显降低(P<0.01)。7.同对照组相比,400μM Na HS组Drp1蛋白表达明显降低(P<0.01),与400μM Na HS组相比,400μM Na HS+PD98059组Drp1蛋白表达明显升高(P<0.01)。结论:1.适当浓度Na HS对线粒体分裂有抑制作用,这种作用有浓度及时间依赖性。2.适当浓度的Na HS可提高细胞活力,提高线粒体ATP产量。3.Na HS可能通过抑制Drp1的表达抑制线粒体分裂。4.ERK1/2通路可能参与了Na HS导致的Drp1表达降低及线粒体分裂减少。第二部分Na HS对APP/PS1双转基因小鼠线粒体分裂融合及认知功能的影响目的:1.探讨Na HS对APP/PS1双转基因小鼠的认知功能损害的改善作用。2.检测认知功能改善的小鼠脑组织中线粒体的形态变化。3.认知功能改善的小鼠Drp1的表达降低与线粒体形态学的变化的关系。4.Na HS对APP/PS1双转基因鼠中的Drp1表达的影响。5.ERK1/2通路在Na HS对Drp1表达中的作用。方法:1.用10,20,50μmol/kg Na HS对10月龄转基因小鼠进行腹腔注射,隔日一次共两月,设空白对照(同龄同窝野生小鼠),阴性对照(同龄转基因鼠腹腔注射生理盐水)。2个月后,用水迷宫法检测各组小鼠认知功能各项指标。2.透射电镜检测各组小鼠线粒体形态学变化。3.免疫组化法对各组小鼠海马区Drp1表达进行半定量分析。4.Western blot,QRT-PCR测定各组小鼠Drp1 m RNA及蛋白表达。5.给予5mg/kg ERK1/2通路抑制剂侧脑室注射及50μmol/kg Na HS腹腔注射两个月后,Western blot检测磷酸化ERK1/2,Drp1表达变化。结果:1.水迷宫实验中,空白对照组与阴性照组相比较,Na HS处理组与阴性对照相比,游泳速度均无明显差异(p>0.05)。定向巡航实验中,与空白对照组相比,阴性对照组的平均潜伏期明显延长(Day3p<0.05,Day4 p<0.001,Day5 p<0.001),游泳距离明显延长(Day3p<0.05,Day4 p<0.01,Day5 p<0.01)。与阴性对照组相比,50μmol/kg Na HS处理组的逃避潜伏期明显缩短(Day3 p<0.05,Day4 p<0.001,Day5 p<0.001),游泳距离明显缩短(Day3 p<0.05,Day4 p<0.01,Day5p<0.01)。20μmol/kg Na HS处理组第5天逃避潜伏期也出现明显缩短(p<0.01),第4天,第5天游泳距离明显缩短(p<0.05)。在空间搜索实验里,同空白对照组比较,阴性对照组的目标象限百分比及穿越平台次数均明显减少(p<0.01)。与阴性对照组相比,50μmol/kg Na HS处理组目标象限百分比及穿越平台次数均明显提高(p<0.01)。2.透射电镜示:与空白对照组相比,阴性对照组转基因鼠海马组织中线粒体的数目出现明显增多(p<0.05),伸长线粒体比例明显减少(p<0.05)。与阴性对照组相比,50μmol/kg Na HS处理组线粒体数目明显增多(p<0.01),伸长线粒体比例明显减少(p<0.01)。3.免疫组化显示阴性对照组海马区Drp1表达水平明显较空白对照组明显升高,Na HS处理组海马区Drp1水平较低。4.与空白对照组相比,Drp1的m RNA及蛋白表达在阴性对照组海马组织中明显升高(p<0.01),与阴性对照组相比,Na HS处理组各组Drp1m RNA及蛋白表达均有不同程度的降低,50μmol/kg Na HS处理组降低最明显(p<0.01)。5.给予5mg/kg ERK1/2通路抑制剂侧脑室注射及50μmol/kg Na HS腹腔注射两个月后,与野生小鼠比较,双转基因鼠P-ERK1/2表达水平明显降低(p<0.01),Drp1表达明显升高(p<0.01),给予Na HS处理后,P-ERK1/2表达水平明显升高(p<0.05),Drp1表达水平明显降低(p<0.05),同时给予PD98059和Na HS后P-ERK1/2表达水平明显降低(p<0.05),Drp1表达水平明显升高(p<0.05)。结论:1.适当浓度的Na HS对12月龄的APP/PS1双转基因小鼠的认知功能损害有一定的改善作用。2.转基因小鼠中有线粒体分裂的异常增多,Na HS可抑制这种异常变化。3.转基因鼠中Drp1表达异常增多,适当浓度的Na HS可抑制Drp1的过度表达。4.ERK1/2通路可能参与了Na HS对转基因鼠Drp1表达异常的改善作用。