【研究背景】椎间盘退变(IDD,Intervertebral Disc Degeneration)是下腰部疼痛最为常见的原因,也是脊柱退变性疾病的始动因素。全世界有6.32亿人患病,严重者可导致劳动能力的丧失,严重的影响了人类的健康。目前针对IDD的主要治疗方法为保守治疗和手术治疗,但以上方法均无法有效控制椎间盘退行性变性的进程。椎间盘退变是一种进行性的疾病,因此,深入揭示椎间盘退变的分子机制,寻找调控相关信号通路和组织病理变化的关键靶分子,开发有针对性的生物治疗方法,对治疗椎间盘退变及其引发的各类疾病有着重要的意义。【目的】我们通过阅读并分析文献,发现,miR-640在退变的椎间盘组织中高表达,而其下游靶基因参与调控NF-κB,WNT等与细胞衰老、凋亡等进程直接相关的信号通路。据此,我们推测,miR-640在椎间盘退变的病理生理过程中可能发挥着重要作用。因此,本研究的主要目的就是,以miR-640的功能及其调控机制研究为突破口,综合利用转染、双荧光素酶报告基因、RNAi等分子生物学技术系统的研究miR-640在椎间盘退变及髓核细胞衰老、凋亡过程中的作用机制,丰富椎间盘退变的理论研究,并为临床椎间盘退变的防治提供潜在的药物作用靶点。【方法】1.人髓核细胞(NP cells)的分离培养。2.提取人椎间盘组织及髓核细胞的总RNA,并通过RT-PCR检测人椎间盘组织及髓核细胞中miR-640的表达情况。3.综合利用qPCR、HE染色、免疫组化染色的方法研究退变髓核细胞中炎症因子的表达情况,及其与miR-640的相关性。4.利用双荧光素酶报告、免疫细胞荧光、生物信息学预测等方法研究NF-κB与miR-640的关系及其在髓核细胞中的分布。5.利用生物信息学分析的方法预测miR-640的下游靶分子,并通过双荧光素酶报告、qPCR证实miR-640对下游靶分子的调控。6.利用SA-β-gal染色检测miR-640过表达髓核细胞的衰老情况。7.流式细胞术测miR-640对髓核细胞衰老及凋亡的影响,CellTiter-Glo试剂盒检测miR-640对髓核细胞活性的影响。【结果】1.在退变的椎间盘组织及髓核细胞中miR-640的表达量显著增高。2.在退变髓核组织中高表达的炎症因子TNF-α和IL-1β能够通过NF-κB信号通路激活miR-640的表达。3.miR-640通过抑制LRP1表达,促进NF-κB的持续激活,构成正反馈环路。4.miR-640能够抑制WNT信号通路的关键分子β-catenin和EP300,故可降低WNT通路活性。5.miR-640能够通过对WNT信号通路的抑制促进髓核细胞的衰老、凋亡。【结论】本研究证实,在衰老退变的髓核组织中形成了炎症微环境,促炎因子与miR-640的表达形成正反馈环路,造成miR-640的大量积累,并抑制其下游WNT通路活性,促进髓核细胞的衰老和凋亡。在此调控网络中,miR-640位于信号通路的关键交叉节点之上,干预其表达可有效减少髓核细胞的凋亡。本研究阐明了髓核细胞退变过程中miR-640相关的分子调控网络,并为治疗椎间盘退变相关的各种疾病提供了潜在的药物作用靶点。