[背景]随着生活水平的提高、生活方式的改变和人口的老龄化,糖尿病患病率在世界范围内呈现出上升趋势,成为继心脑血管疾病、肿瘤之后的又一严重危害大众健康的慢性非传染性疾病。目前全球已诊断的糖尿病患者超过1.5亿人,预测到2025年将增至3亿人。糖尿病合并严重感染是糖尿病最常见的并发症之一。在应用胰岛素治疗以前,感染是糖尿病的主要死因,直至二十世纪五十年代,糖尿病患者仍有较高的死亡率。近年来,随着胰岛素和抗生素的应用,糖尿病并发感染的死亡率有所下降,但仍占糖尿病死亡原因第二位。糖尿病患者的感染发生率高达36.8%,并仍有上升的趋势。因此,有效地防治感染对于降低糖尿病患者的死亡率非常重要。目前认为糖尿病患者易并发各种感染,主要与高血糖状态、机体防御机能减弱、糖尿病的并发症、营养不良等因素有关,其中比较受关注的是机体防御机能减弱。控制不良或伴酮症酸中毒的糖尿病患者常同时有多种防御机能缺陷,对入侵微生物的的各反应阶段都被抑制,从而极易感染,且程度严重。白细胞在抗感染方面发挥着重要作用。它参与机体非特异性免疫和特异性免疫过程,有吞噬、杀死病原体的作用,是机体抗感染的第一道防线。许多研究对糖尿病患者白细胞吞噬杀菌功能进行了研究,发现血糖控制差的糖尿病患者,中性粒细胞的趋化、粘附、吞噬及氧化杀菌等功能均较正常人低,且与病情控制及代谢紊乱的程度有关。多数糖尿病患者白细胞的超微结构亦有异常。近年来,对糖尿病患者白细胞吞噬杀菌功能降低机制的研究越来越重视,国内外很多学者分别从糖尿病患者白细胞膜脂流动性、胞内碱性磷酸酶活力、溶酶体酶、调理素、Ca2+浓度、山梨醇及肌醇代谢状态等方面进行了研究,但仍无定论。呼吸爆发是白细胞激活后行使杀菌功能的主要途径。白细胞吞噬病原体后,主要通过呼吸爆发过程中,NADPH氧化酶(NOX)介导产生的大量活性氧(ROS)成分与其他细胞因子共同作用才能有效地杀死病原体。NOX是呼吸爆发的关键酶,呼吸爆发的过程实际上就是NOX激活的过程。目前的研究发现,NOX蛋白家族是细胞产生ROS的重要酶类,主要包括NOX1、NOX2(gp91phox)、NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1、DUOX2几个亚型。白细胞中的NOX为NOX2,主要由2个膜蛋白亚单位(gp91phox和p22phox),3个细胞质亚单位(p47phox、p67phox和p40phox),一个小分子量蛋白Rac以及最新发现的p29peroxiredoxin构成。p47phox对于维持体内中性粒细胞的正常杀菌功能是必须的,它是NOX活化的起始点。当中性粒细胞受到外界刺激被活化后,首先是胞质中的p47phox被大量磷酸化,使得其构象发生变化,分子间的紧密结合被打开,p67phox利用C端的SH3区域与p47phox磷酸化后所暴露出来的SH3和PX结构域结合,而磷酸化的p47phox则携带p67phox、 p40phox向胞膜转移,利用暴露的N端的SH3区域与p22phox(?)(?)出于细胞质中的尾部相结合,从而实现了胞膜亚单位与胞质亚单位在胞膜上的集合与装配,最后在胞膜上形成有活性的NOX,发挥其生物学作用。因此p47phox磷酸化水平可直接反映NOX的活化程度。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)是细胞内磷酸戊糖途径(PPP)的关键酶。对G6PD的研究早在上世纪80年代就已进入DNA水平,研究主要集中在G6PD缺乏症基因突变方面。近年来,美国哈佛大学医学院Joslin糖尿病中心研究发现G6PD与糖尿病肾病、血管内皮细胞功能等均存在密切联系。目前认为,G6PD不仅与糖尿病及其并发症存在密切关系,还是白细胞正常发挥呼吸爆发功能的重要物质。其活性直接关系到呼吸爆发的必需物质NADPH的生成。除G6PD外,NOX在呼吸爆发中亦起至关重要的作用。由于在NOX蛋白家族中,NOX2主要存在于吞噬细胞,常被称为吞噬细胞NADPH氧化酶,是吞噬细胞抗菌系统的主要成分。吞噬细胞呼吸爆发的启动始于NOX2激活。NOX活性与呼吸爆发功能的正常发挥密切相关。在呼吸爆发原料NADPH供应充足时,如果NOX活化受阻,吞噬细胞的呼吸爆发仍然不能正常启动。可见,吞噬细胞呼吸爆发的正常发挥既需要保证PPP通路为其提供充足的供氢体以满足其一系列化学反应的需求,还需要其关键酶的正常激活来启动并催化呼吸爆发反应。两者缺一不可。我们的前期研究主要观察了糖尿病外周血白细胞呼吸爆发功能与G6PD活性之间的关系。实验发现,持续的高糖环境刺激可明显降低白细胞G6PD活性,影响NADPH的产量。白细胞内NADPH含量与G6PD活性的改变一致,并直接影响细胞的ROS产生能力,妨碍呼吸爆发功能的发挥。高糖刺激下白细胞呼吸爆发功能降低与G6PD活性减弱明显相关。与健康成人相比,2型糖尿病患者外周血白细胞G6PD活性、NADPH含量及细胞内ROS水平均明显降低,提示高糖可能通过影响白细胞G6PD活性进而影响呼吸爆发。2型糖尿病患者中,血糖控制不良的患者与血糖控制良好的患者相比,其G6PD酶活性、NADPH含量及细胞内ROS水平的下降幅度更大,白细胞呼吸爆发功能障碍更明显。那么,除G6PD活性降低导致呼吸爆发原料NADPH产生减少而影响糖尿病患者白细胞呼吸爆发功能,是否还存在其他机制导致糖尿病患者白细胞呼吸爆发功能障碍呢?对此,我们进行了进一步研究。本研究将采用含不同浓度葡萄糖培养液离体培养的人单核细胞株THP-1细胞作为研究对象,观察细胞周围环境中葡萄糖浓度对其呼吸爆发功能的影响,并探讨高糖介导的呼吸爆发功能改变的可能信号转导机制。研究分为以下三部分进行：[目的]通过检测不同处理组的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)活性、NOX活性及ROS产量,探讨高糖介导呼吸爆发障碍的可能途径。[方法]1.以人单核细胞株THP-1细胞为实验对象,分为3组：高糖组(33.3mmol/L葡萄糖),空白对照组(11.1mmol/L葡萄糖)、G6PD抑制组(11.1mmol/L葡萄糖+100umol/LDHEA),每组6例。2.培养48h后,给予10umol/LFMLP处置30mmin,用分光光度法检测THP-1细胞内G6PD活性及NOX活性,用荧光探针法检测细胞内ROS产量。3.实验数据计量资料以均数±标准差(x±s)表示。采用SPSS16.0软件进行统计分析。多组间资料比较用单因素方差分析(one-way ANOVA)。检验标准α定为0.05。[结果]1.与空白对照组相比,高糖组及G6PD抑制组的G6PD活性、NOX活性及ROS产量均明显降低,均存在显著差异(P<0.01)。2.高糖组与G6PD抑制组相比,其G6PD活性下降幅度相似,无显著差异(P>0.05),其NOX活性及ROS产量降低更显著(P<0.01)。[结论]1.正常糖浓度培养下,给予G6PD抑制剂处理后,THP-1细胞的ROS释放量下降,NOX活性亦下降,呼吸爆发功能启动受到阻碍,ROS生成减少,提示单纯抑制G6PD活性可导致THP-1细胞呼吸爆发功能障碍。2.高糖环境不仅抑制G6PD活性,来阻碍THP-1细胞呼吸爆发障碍,还直接抑制THP-1细胞的NOX活性,导致ROS产量减少,呼吸爆发功能受损。[目的]利用PKA特异性抑制剂PKI和PKA激动剂(?)Forskolin预处理不同浓度葡萄糖培养的THP-1细胞。探讨cAMP-PKA信号通路在高糖介导的THP-1细胞G6PD活性改变及呼吸爆发功能障碍中的作用。[方法]1.以人单核细胞株THP-1细胞为实验对象,分为4组：高糖组(33.3mmol/LD-GLU)、空白对照组(11.1mmol/LD-GLU)、PKA抑制组(33.3mmol/LD-GLU+1Oumol/L PKI)、PKA激动组(11.1mmol/LD-GLU+20umol/LForskolin),每组6例。2.培养48h后,给予10umol/L FMLP处置30min,用分光光度法检测THP-1细胞内G6PD活性及NOX活性,用荧光探针法检测细胞内ROS产量,用ELISA法检测cAMP含量。3.实验数据计量资料以均数±标准差(x±s)表示。采用SPSS16.0软件进行统计分析。多组间资料比较用单因素方差分析(one-way ANOVA)。检验标准α定为0.05。[结果]1.与空白对照组相比,高糖组及PKA激动组的G6PD活性、NOX活性及ROS产量均明显降低,均存在显著差异(P<0.01),PKA抑制组的G6PD活性、NOX活性及ROS产量未见明显改变(P>0.05)。高糖组与PKA激动组相比,其G6PD活性、NOX活性及ROS产量无显著差异(P>0.05)。2.与空白对照组相比,高糖组及PKA激动组的cAMP含量均明显升高,存在显著差异((P<0.01)。PKA抑制组的cAMP含量与空白对照组相比,无明显差异(P>0.05)。高糖组与PKA激动组相比,其cAMP含量无显著差异(P>0.05)。[结论]1.持续的高浓度葡萄糖干预可明显降低激活状态下THP-1细胞的G6PD活性、NOX活性及ROS产量。高糖环境可同时降低NOX活性及G6PD活性,导致其呼吸爆发功能障碍。2.PKA抑制剂能提高持续高糖培养的THP-1细胞G6PD活性、NOX活性及ROS产量,从而恢复高糖所致的THP-1细胞呼吸爆发功能障碍。提示高糖介导的THP-1细胞呼吸爆发功能障碍与PKA通路激活有关。[目的]通过检测不同处理组的G6PD、Raf-1、ERK、p47phox(?)的磷酸化水平,探讨cAMP-PKA信号通路抑制高糖环境下的THP-1细胞呼吸爆发功能的可能机制。[方法]1.以人单核细胞株THP-1细胞为实验对象,分为4组：高糖组(33.3mmol/LD-GLU)、空白对照组(11.1mmol/LD-GLU)、PKA抑制组(33.3mmol/LD-GLU+10umol/L PKI)、PKA激动组(11.1mmol/LD-GLU+20umol/LForskolin),每组6例。2.培养48h后,给予10umol/L FMLP处置30min,用Western-blot法检测各组G6PD、Raf-1、ERK、JNK、p38MAPK及p47phox的表达及磷酸化水平。3.实验数据计量资料以均数±标准差(x±s)表示。采用SPSS16.0软件进行统计分析。多组间资料比较用单因素方差分析(one-wav ANOVA)。检验标准α定为0.05。[结果]1.与空白对照组相比,高糖组及PKA激动组的G6PD磷酸化表达增加,均存在显著差异(P<0.01)；PKA抑制组的G6PD磷酸化表达未见明显改变(P>0.05)。2.与空白对照组相比,高糖组及PKA激动组的Raf-1磷酸化表达增加,ERKJNK及p38MAPK的磷酸化表达均减少,均存在显著差异(P<0.01)；PKA抑制组的Raf-1、ERK、JNK及p38MAPK的磷酸化表达未见明显改变(P>0.05)。3.与空白对照组相比,高糖组及PKA激动组的p47phox磷酸化表达减少,均存在显著差异(P<0.01)；PKA抑制组的p47phox磷酸化表达未见明显改变(P>0.05)。[结论]1.持续的高浓度葡萄糖干预可明显增加激活状态下THP-1细胞的Raf-1磷酸化表达,同时降低ERK、JNK、p38MAPK的磷酸化表达水平,从而使p47phox磷酸化表达减少,PKA激动剂同样可使正常糖浓度培养的THP-1细胞发生相同的磷酸化水平改变。提示cAMP-PKA信号通路通过阻断了MAPK通路中包括Ras/Raf/MEK/ERK、JNK及p38MAPK在内的多条支路,来实现对p47phox活化的抑制,导致呼吸爆发功能障碍。2.持续的高浓度葡萄糖干预还可直接增加G6PD磷酸化,且同时伴随p47phox磷酸化水平下降,提示高糖还可直接通过增加G6PD磷酸化来抑制G6PD活性,从而减少NADPH生成来抑制呼吸爆发功能。3.PKA抑制剂能减少Raf-1磷酸化水平,提高ERK JNK及p38MAPK的磷酸化水平,从而增加p47phox的磷酸化水平,说明抑制cAMP-PKA信号通路可逆转高糖对呼吸爆发的抑制。进一步验证了MAPK通路中Ras/Raf/MEK/ERK、JNK及p38MAPK多条支路均参与了高糖介导的cAMP-PKA信号通路激活所致的呼吸爆发障碍。